骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、病毒性肝炎是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病，特別是乙型肝炎病毒(HBV)所引起的乙型病毒性肝炎，全球約有3億以上慢性病毒性肝炎及其病毒攜帶者，而我國是一個(gè)病毒性肝炎大國，約有1.2億慢性病毒性肝炎感染者。由于各種原因所引起的病毒反復(fù)活動(dòng)破壞肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，可引起肝細(xì)胞的變性、壞死，纖維組織增生和肝細(xì)胞結(jié)節(jié)狀再生，從而進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，已成為威脅肝病患者生命的主要原因。目前原位肝移植(OLT)是治療各種肝功能失代償期、肝功能衰竭期最有

2、效的治療方法，但因?yàn)楦卧慈狈Α①M(fèi)用昂貴、以及移植后的并發(fā)癥等限制了OLT的廣泛應(yīng)用。
　　 近年來，新的干預(yù)性治療不斷出現(xiàn)，通過進(jìn)行干細(xì)胞移植，利用外源性的具有高度增殖活性和多向分化能力的干細(xì)胞移植來達(dá)到損傷組織或細(xì)胞的修復(fù)與再生的目的。間充質(zhì)來源的成體干細(xì)胞稱間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，其概念最初是由Friedenstein和同事于20世紀(jì)70年代提出的，F(xiàn)riedenstein和同事在培養(yǎng)骨髓細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)一種與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，

3、貼壁生長的梭形細(xì)胞，有集落形成能力，在體內(nèi)和體外均可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞。目前證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞存在于機(jī)體的多種組織中，包括臍帶、臍帶血、骨髓、脂肪、外周血、骨骼肌等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是指來源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞，是間充質(zhì)干細(xì)胞所有種類中來源最豐富和應(yīng)用最廣泛的一種細(xì)胞。體外大量研究證實(shí)了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有著高度的自我更新能力和較強(qiáng)的多胚層分化潛能，在特定因素誘導(dǎo)下可以分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、脂肪

4、細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、心肌細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肝細(xì)胞。
　　 大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究表明，骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞移植用于治療肝臟相關(guān)性疾病中可獲得以下效果:先天性肝臟代謝缺陷疾病的糾正，可改善肝性腦病癥狀，暫時(shí)性替代部分肝細(xì)胞和肝臟組織的功能，提高血清白蛋白水平，降低血清轉(zhuǎn)氨酶、血氨及總膽紅素水平。隨著干細(xì)胞研究的深入，BMSCs移植在不久的將來會(huì)成為臨床肝臟疾病治療的常規(guī)手段。
　　 目的:
　　 1、探索體

5、外分離純化、凍存大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的最適方法，探討體外培養(yǎng)BMSCs是否具有成瘤性，為其成為組織工程與臨床康復(fù)理想的種子細(xì)胞提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 2、探索不同途徑移植GFP標(biāo)記的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)在慢性肝纖維化的作用，以及移植后細(xì)胞在肝臟組織內(nèi)存活、分布情況，為臨床BMSCs應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　

6、 1、購清潔級(jí)別SD雄性大鼠，6只，1月齡，利用沖洗骨髓腔的方法所獲得大鼠BMSCs，加入含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，吹打混勻后給予相應(yīng)的處理。A組給予1.5h棄貼壁細(xì)胞，24h首次換液后繼續(xù)培養(yǎng);B組24h首次換液后繼續(xù)培養(yǎng);C組48h首次換液后培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況及形態(tài)學(xué)變化。
　　 2、待P3細(xì)胞長至80％—85％匯合，消化細(xì)胞后向沉淀物中加入血清濃度分別為10％、20％、30％、40％、50％的細(xì)胞

7、冷凍液，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×106個(gè)/mL后置于梯度凍存盒，-80℃冰箱短期保存。1月后行凍存細(xì)胞復(fù)蘇。輕輕吹吸混勻后分為三組，A組細(xì)胞復(fù)蘇后行臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算細(xì)胞存活率;B組細(xì)胞懸液接種到96孔板培養(yǎng)，分別在接種后第1到8天每天取3個(gè)孔，行活細(xì)胞計(jì)數(shù)后繪制出細(xì)胞生長曲線;C組成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)D21天后行油紅O染色，觀察復(fù)蘇后細(xì)胞成脂能力。
　　 3、購SPF級(jí)裸鼠，6只，1月齡，實(shí)驗(yàn)組將P3、P15代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

8、行免疫組織化學(xué)染色和成脂誘導(dǎo)鑒定后，分別通過裸鼠后肢股四頭肌肌肉、肝臟組織局部注射體內(nèi)移植，對(duì)照組以生理鹽水局部注射至相應(yīng)部位。觀察裸鼠生存狀態(tài)及接種部位有無新生物形成，45天后行注射部位病理組織標(biāo)本HE染色檢查觀察有無異型細(xì)胞生長。
　　 4、購清潔級(jí)SD雄性大鼠，15只，300±50g，將苯巴比妥鈉注射液350mg/L混于純水中供大鼠飲用，7天后按每100g0.125ml/四氯化碳橄欖油混合液(2∶3)給予大鼠灌胃，2次/周

9、，持續(xù)8周。8周后將存活下來的肝硬化模型大鼠行肝功能檢測，根據(jù)檢測結(jié)果將成功造模的肝硬化大鼠隨機(jī)分為尾靜脈移植組、肝臟局部注射組、肝動(dòng)脈注射組、肝門靜脈注射組和肝硬化未移植組。
　　 5、購清潔級(jí)SD雄性大鼠，2只，1月齡，利用全骨髓差速貼壁法分離、培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，取第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，一部分用于CD34、CD44免疫組織化學(xué)染色和成脂誘導(dǎo)鑒定，一部分利用攜帶EGFP基因的慢病毒載體感染標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
　

10、　 6、通過尾靜脈、肝臟局部注射、肝動(dòng)脈注射、肝門靜脈四種注射途徑將標(biāo)記好的BMSCs移植到肝硬化模型大鼠體內(nèi)，移植后維持四氯化碳肝損傷，1月后處死大鼠檢測血清白蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo);取肝臟組織行HE染色和天狼星紅-苦味酸染色觀察肝硬化程度;取肝臟組織白片在熒光顯微鏡下觀察切片組織熒光分布情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、A組可見大量骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長，多為短梭形和不規(guī)則三角形，核橢圓形，較大，有的可見

11、雙核， B組、C組除了可見短梭形細(xì)胞外，還可見較大的圓形細(xì)胞及長梭形細(xì)胞貼壁，細(xì)胞組成形態(tài)較A組復(fù)雜。
　　 2、凍存與復(fù)蘇對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的存活和增殖能力存在一定的影響，細(xì)胞生長潛伏期延長，隨著血清濃度的遞減這種影響也愈加明顯;接種密度偏高利于細(xì)胞復(fù)蘇后生長與增殖，含30％血清組接種密度過低，細(xì)胞生長速度較其他各組慢，但待細(xì)胞增殖到某一數(shù)量后細(xì)胞增殖速度明顯加快。
　　 3、BMSCs傳至15代仍保持間充質(zhì)干細(xì)胞特性

12、，BMSCs移植入裸鼠肝臟45天后可在局部肝臟存活，生長狀態(tài)與體外培養(yǎng)相似，無異型性及向周圍浸潤生長。
　　 4、全骨髓差速貼壁法24h后給予全量換液去除未貼壁細(xì)胞后，可見散在貼壁細(xì)胞，形態(tài)較為均一，成短梭形或星形。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增長，逐漸出現(xiàn)放射狀排列的細(xì)胞集落。7-12天細(xì)胞增殖旺盛，集落逐漸融合，排列緊密并成旋渦狀。P3代細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色CD34-，CD44+，成脂誘導(dǎo)油紅O染色(+)，具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性

13、。
　　 5、肝功能檢測提示苯巴比妥聯(lián)合四氯化碳誘導(dǎo)大鼠慢性肝纖維化損傷持續(xù)8周（移植前）各組白蛋白( Alb)水平均較正常大鼠低，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性均較正常大鼠高，移植后各組Alb持續(xù)性下降，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶水平因肝損傷刺激的減少也逐漸下降，且各組下降幅度相當(dāng)。
　　 6、不同途徑大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后肝臟組織病理組織切片HE染色示正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞排列紊亂，可見大量肝細(xì)胞

14、空泡變性，門管區(qū)有廣泛的膠原纖維增生，向小葉內(nèi)伸展，形成假小葉。天狼猩紅-苦味酸染色示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組和對(duì)照生理鹽水注射組在肝門靜脈區(qū)和肝實(shí)質(zhì)內(nèi)均有大量紅染膠原纖維沉積，形成假小葉。
　　 7、經(jīng)GFP標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)類似，隨著體外培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞的綠色熒光逐漸減退，變成黃綠色甚至黃色。移植后四周肝臟局部組織切片免疫熒光顯微鏡下觀察示:尾靜脈移植組在門管區(qū)纖維間隔內(nèi)可見大量表達(dá)黃色熒光

15、信號(hào)的細(xì)胞，局部注射組、肝動(dòng)脈組、門靜脈組亦分別在局部注射部位、小葉間動(dòng)脈、小葉間靜脈（中央靜脈）等部位見到黃色熒光表達(dá)，且均分布在膠原纖維含量較多的部位。
　　 結(jié)論:
　　 1、本實(shí)驗(yàn)首次利用1.5h差速貼壁結(jié)合24h首次全量換液法，在原代即可獲得形態(tài)均一、增殖速度快、性狀穩(wěn)定的BMSCs，且具有操作簡單、快捷、實(shí)用、對(duì)細(xì)胞損傷小等優(yōu)點(diǎn)，為其作為組織工程種子細(xì)胞提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 2、含30％濃度的血清凍

16、存液凍存骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，既可最大化的保證骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞活性及增殖能力，又可保證其遺傳特性和多分化的能力。
　　 3、體外長時(shí)間培養(yǎng)BMSCs在15代以內(nèi)移植入裸鼠體內(nèi)可以在局部肝臟內(nèi)存活，且沒有成瘤性，隨著體外培養(yǎng)傳代次數(shù)的增多其具有成瘤性的風(fēng)險(xiǎn)增加。
　　 4、免疫熒光顯微鏡下觀察表達(dá)熒光信號(hào)的細(xì)胞在肝小葉內(nèi)的分布不同，考慮可能與細(xì)胞移植途徑有關(guān)，但均分布在肝小葉匯管區(qū)或小葉血管周圍膠原纖維沉積較多的部位。