骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)糖尿病大鼠治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 糖尿病(diabetes reellitus，DM)的發(fā)病是由β-細(xì)胞漸進(jìn)性的衰退或功能障礙引起的胰島素合成和分泌不足所引起，傳統(tǒng)的胰島素和口服降糖藥治療只能對(duì)癥處理，并不能阻止胰島β細(xì)胞功能的進(jìn)行性衰竭和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。因此，糖尿病的再生替代治療已成為世界范圍研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。糖尿病再生替代治療有胰腺移植、胰島移植以及干細(xì)胞移植治療。胰腺移植和胰島移植由于供體的缺乏和免疫排異反應(yīng)而制約了其在臨床的發(fā)展。在糖尿

2、病的干細(xì)胞治療領(lǐng)域，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞引起人們更多的關(guān)注。 間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓中非造血干細(xì)胞的一種干細(xì)胞，是由中胚層發(fā)育的早期細(xì)胞，具有多向分化潛能，不僅能分化為造血實(shí)質(zhì)，支持造血，還可以分化為多種造血以外的組織細(xì)胞，MSCs已被證明可在體外誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，由此可見，其分化潛能不僅僅局限于中胚層組織，而且在特定的條件下可以

3、向內(nèi)胚層和外胚層的組織細(xì)胞分化。另外，已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明血液中的MSCs具有定向遷移至受損器官或組織的能力，如MSCs可定向遷移并停留于骨、軟骨損傷部位、心肌梗死或缺血性腦損傷等部位，故移植MSCS后可明顯促進(jìn)病變局部骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)等細(xì)胞的修復(fù)重建。所以，近年來，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-mesenchymal stem cells，BM-MSCs)的功能作用和臨床應(yīng)用成為醫(yī)學(xué)界普遍關(guān)注的研究熱點(diǎn)，其已經(jīng)成為一種理想

4、的組織工程的種子細(xì)胞。BM-MSCs不僅具有取材方便、擴(kuò)增迅速的特點(diǎn)，更重要的一點(diǎn)在于患者可以利用自身骨髓來源的干細(xì)胞治療疾病，實(shí)現(xiàn)真正的自體移植，從而克服移植排斥反應(yīng)。因此，MSCs作為一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，已經(jīng)成為人們尋找胰島β細(xì)胞替代物的新資源。目前，多項(xiàng)研究已證實(shí)了骨髓源性干細(xì)胞在特定條件下培養(yǎng)，可被誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細(xì)胞(insulin-producing cells,IPCs)。Tang DQ等的研究表明，

5、小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為表達(dá)一系列胰島β細(xì)胞相關(guān)基因(胰島素Ⅰ和Ⅱ，GLUT-2，葡萄糖激酶，胰島淀粉樣多肽，PDX-1等)，此細(xì)胞接受葡萄糖刺激后，免疫細(xì)胞化學(xué)和電鏡證實(shí)有胰島素和C肽的表達(dá)，把這些IPCs形成的集合體用微囊包裹，移植到高血糖大鼠腎包膜內(nèi)后，空腹及腹腔糖耐量試驗(yàn)均有所改善。Banerjee等的實(shí)驗(yàn)表明，骨髓在高血糖狀態(tài)下仍保留了它的干細(xì)胞性質(zhì)。這些研究表明，糖尿病人有望利用自身的BM-MSCs來治療DM

6、。在此基礎(chǔ)之上，本研究選取糖尿病大鼠的骨髓，建立適宜的BM-MSCs體外培養(yǎng)體系，并通過形態(tài)學(xué)特征、表面標(biāo)志以及多向分化功能等方面進(jìn)行鑒定，并證實(shí)高糖狀態(tài)下BM-MSCs的分化能力；同時(shí)在糖尿病大鼠模型中，同種異體移植糖尿病大鼠的BM-MSCs，觀察BM-MSCs移植對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的治療作用并進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。 本研究由兩部分組成：第一部分探討從大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)BM-MSCs的方法，并對(duì)高血糖狀態(tài)下BM-M

7、SCs的分化能力進(jìn)行鑒定和證實(shí)，第二部分觀察BM-MSCs移植對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的作用。 目的： (1)探索從糖尿病大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)MSCs的方法，建立大鼠BM-MSCs的體外培養(yǎng)體系，為后續(xù)的干細(xì)胞研究提供穩(wěn)定的細(xì)胞模型。 (2)將體外培養(yǎng)的BM-MSCs移植入糖尿病大鼠體內(nèi)，探討B(tài)M-MSCs移植是否有助于糖尿病的治療及可能的作用機(jī)制。 方法： (1)采用經(jīng)典的全骨髓貼壁法培養(yǎng)BM-M

8、SCs，在含10％胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得大鼠BM-MSCs。通過成骨、成脂肪等多向誘導(dǎo)分化以及流式細(xì)胞儀分析其表面標(biāo)記(CD44，CD34，CD45，CD90)等鑒定MSCs特征。取三代(P3)的BM-MSCs用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 (2)以BrdU標(biāo)記BM-MSCs，臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定BrdU標(biāo)記后細(xì)胞活率。建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的模型，實(shí)驗(yàn)大鼠共分為3組，正常對(duì)照組大鼠10只(無DM，尾靜脈注射0.1M檸檬酸

9、緩沖液)；糖尿病大鼠分為2組：DM對(duì)照組10只(DM，但不移植MSCs)；實(shí)驗(yàn)組10只(DM，移植MSCs)。觀察移植術(shù)后三組大鼠的體重、血糖、血漿胰島素水平變化情況，并取各組胰腺組織制備切片，通過免疫組化、免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)觀察大鼠胰腺移植細(xì)胞情況。 結(jié)果： (1)48h后可見散在貼壁細(xì)胞，形態(tài)呈成纖維樣，72h后通過全量換液去除殘留的各種血細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)的MSCs呈單個(gè)分散存在或形成幾個(gè)細(xì)胞的克隆，7～10天后，貼壁

10、細(xì)胞數(shù)目明顯增多，呈梭形或長(zhǎng)多邊形，形態(tài)不完全均一，但細(xì)胞排列整齊，邊界清晰，在培養(yǎng)瓶中分布及生長(zhǎng)均勻。原代培養(yǎng)10～14天細(xì)胞可達(dá)80～90％融合，0.25％胰蛋白酶常規(guī)消化，按1:2的比例傳代，傳代后的BM-MSCs形態(tài)與原代基本相似，經(jīng)過3代后BM-MSCs基本達(dá)到形態(tài)均一。流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表型的鑒定分析顯示BM-MSCs高表達(dá)CD44、CD90，而CD34、CD45、MHCI低表達(dá)或表達(dá)陰性，誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明BM-MSCs在體外具

11、有向中胚層3種細(xì)胞(骨、軟骨和脂肪細(xì)胞)及外胚層細(xì)胞(神經(jīng)細(xì)胞)分化的能力，表明我們分離培養(yǎng)的BM-MSCs為具有均一細(xì)胞表面特征的細(xì)胞群，是一群區(qū)別于造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells，HSCs)并具有多向分化潛能的非定向干細(xì)胞。 (2)BrdU標(biāo)記的BM-MSCs免疫熒光染色后可見細(xì)胞核為DAPI/BrDu雙染，即藍(lán)/綠雙染，標(biāo)記陽(yáng)性率89.5％。臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定BrdU標(biāo)記后細(xì)胞活率，可見標(biāo)記后細(xì)胞

12、活率99％±0.6％。Wistar大鼠按60 mg/kg體重尾靜脈注射1％STZ溶液，造模成功率為22/25。實(shí)驗(yàn)過程中，正常對(duì)照組血糖保持在(4.6±0.7～5.6±1.0)mmol/L，DM對(duì)照組血糖在(24.2±2.3～27.8±2.1)mmol/L，實(shí)驗(yàn)組血糖在(17.7±3.9～26.1±3.2)mmol/L。其中，在BM-MSCs移植后，實(shí)驗(yàn)組較DM對(duì)照組血糖有下降趨勢(shì)，尤其在第45天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組較DM對(duì)照組血糖明顯降低(17

13、.7 mmol/L±3.9 vs 27.8 mmol/L±2.1，P＜0.05)。各時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組、DM對(duì)照組血糖均高于正常組(均P＜0.05)。在體重方面，正常對(duì)照組體重逐漸增加，DM對(duì)照組體重降低，而實(shí)驗(yàn)組體重變化不明顯；在第45天時(shí)，DM對(duì)照組較正常對(duì)照組體重明顯降低(133.3g±13.1 vs.358.8g±21.6，P＜0.05)；另外，實(shí)驗(yàn)組較DM對(duì)照組體重亦顯著增加(232.7 g±19.7 vs 133.3g±13.1

14、，P＜0.05)。在第45天時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組血漿胰島素水平存在差異。其中，DM對(duì)照組較正常對(duì)照組血漿胰島素水平明顯降低(10.3mIU/ml±2.3 vs。33.2mIU/ml±3.8，P＜0.05)；實(shí)驗(yàn)組較DM對(duì)照組血漿胰島素水平則顯著增加(19.8 mIU/ml±4.8 vs 10.3mIU/ml±2.3，P＜0.05)。各組胰腺組織免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果顯示，與DM對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組胰島易見，體積小、多數(shù)位于導(dǎo)管附近，提示多

15、為來源于胰腺導(dǎo)管上皮的新生胰島，與正常對(duì)照組胰島比較，實(shí)驗(yàn)組單個(gè)新生胰島面積和直徑均明顯小于正常對(duì)照組(P＜0.05)。另外，實(shí)驗(yàn)組免疫熒光雙標(biāo)記染色結(jié)果顯示，BrdU標(biāo)記的BM-MSCs移植后可在胰腺組織中出現(xiàn)，多分布在胰腺導(dǎo)管周圍，細(xì)胞核呈綠色熒光，提示有BM-MSCs歸巢于胰腺；同時(shí)，可觀察到少數(shù)綠色細(xì)胞核、紅色細(xì)胞漿的雙染細(xì)胞，說明這種細(xì)胞為移植的BM-MSCs，且能夠分泌胰島素，提示有少量歸巢于胰腺的BM-MSCs轉(zhuǎn)分化為胰島