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文檔簡介
1、研究背景 糖尿病(diabetes reellitus,DM)的發(fā)病是由β-細胞漸進性的衰退或功能障礙引起的胰島素合成和分泌不足所引起,傳統(tǒng)的胰島素和口服降糖藥治療只能對癥處理,并不能阻止胰島β細胞功能的進行性衰竭和糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。因此,糖尿病的再生替代治療已成為世界范圍研究者關(guān)注的焦點。糖尿病再生替代治療有胰腺移植、胰島移植以及干細胞移植治療。胰腺移植和胰島移植由于供體的缺乏和免疫排異反應(yīng)而制約了其在臨床的發(fā)展。在糖尿
2、病的干細胞治療領(lǐng)域,骨髓間充質(zhì)干細胞引起人們更多的關(guān)注。 間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是存在于骨髓中非造血干細胞的一種干細胞,是由中胚層發(fā)育的早期細胞,具有多向分化潛能,不僅能分化為造血實質(zhì),支持造血,還可以分化為多種造血以外的組織細胞,MSCs已被證明可在體外誘導(dǎo)分化為成骨細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞、脂肪細胞、心肌細胞等,由此可見,其分化潛能不僅僅局限于中胚層組織,而且在特定的條件下可以
3、向內(nèi)胚層和外胚層的組織細胞分化。另外,已有動物實驗證明血液中的MSCs具有定向遷移至受損器官或組織的能力,如MSCs可定向遷移并停留于骨、軟骨損傷部位、心肌梗死或缺血性腦損傷等部位,故移植MSCS后可明顯促進病變局部骨、軟骨、肌肉、神經(jīng)等細胞的修復(fù)重建。所以,近年來,骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)的功能作用和臨床應(yīng)用成為醫(yī)學(xué)界普遍關(guān)注的研究熱點,其已經(jīng)成為一種理想
4、的組織工程的種子細胞。BM-MSCs不僅具有取材方便、擴增迅速的特點,更重要的一點在于患者可以利用自身骨髓來源的干細胞治療疾病,實現(xiàn)真正的自體移植,從而克服移植排斥反應(yīng)。因此,MSCs作為一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞,已經(jīng)成為人們尋找胰島β細胞替代物的新資源。目前,多項研究已證實了骨髓源性干細胞在特定條件下培養(yǎng),可被誘導(dǎo)分化成胰島素分泌細胞(insulin-producing cells,IPCs)。Tang DQ等的研究表明,
5、小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞可在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為表達一系列胰島β細胞相關(guān)基因(胰島素Ⅰ和Ⅱ,GLUT-2,葡萄糖激酶,胰島淀粉樣多肽,PDX-1等),此細胞接受葡萄糖刺激后,免疫細胞化學(xué)和電鏡證實有胰島素和C肽的表達,把這些IPCs形成的集合體用微囊包裹,移植到高血糖大鼠腎包膜內(nèi)后,空腹及腹腔糖耐量試驗均有所改善。Banerjee等的實驗表明,骨髓在高血糖狀態(tài)下仍保留了它的干細胞性質(zhì)。這些研究表明,糖尿病人有望利用自身的BM-MSCs來治療DM
6、。在此基礎(chǔ)之上,本研究選取糖尿病大鼠的骨髓,建立適宜的BM-MSCs體外培養(yǎng)體系,并通過形態(tài)學(xué)特征、表面標志以及多向分化功能等方面進行鑒定,并證實高糖狀態(tài)下BM-MSCs的分化能力;同時在糖尿病大鼠模型中,同種異體移植糖尿病大鼠的BM-MSCs,觀察BM-MSCs移植對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的治療作用并進一步探討其可能的作用機制。 本研究由兩部分組成:第一部分探討從大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)BM-MSCs的方法,并對高血糖狀態(tài)下BM-M
7、SCs的分化能力進行鑒定和證實,第二部分觀察BM-MSCs移植對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的作用。 目的: (1)探索從糖尿病大鼠骨髓中分離、培養(yǎng)MSCs的方法,建立大鼠BM-MSCs的體外培養(yǎng)體系,為后續(xù)的干細胞研究提供穩(wěn)定的細胞模型。 (2)將體外培養(yǎng)的BM-MSCs移植入糖尿病大鼠體內(nèi),探討B(tài)M-MSCs移植是否有助于糖尿病的治療及可能的作用機制。 方法: (1)采用經(jīng)典的全骨髓貼壁法培養(yǎng)BM-M
8、SCs,在含10%胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),獲得大鼠BM-MSCs。通過成骨、成脂肪等多向誘導(dǎo)分化以及流式細胞儀分析其表面標記(CD44,CD34,CD45,CD90)等鑒定MSCs特征。取三代(P3)的BM-MSCs用于后續(xù)實驗。 (2)以BrdU標記BM-MSCs,臺盼藍染色測定BrdU標記后細胞活率。建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的模型,實驗大鼠共分為3組,正常對照組大鼠10只(無DM,尾靜脈注射0.1M檸檬酸
9、緩沖液);糖尿病大鼠分為2組:DM對照組10只(DM,但不移植MSCs);實驗組10只(DM,移植MSCs)。觀察移植術(shù)后三組大鼠的體重、血糖、血漿胰島素水平變化情況,并取各組胰腺組織制備切片,通過免疫組化、免疫熒光雙標記技術(shù)觀察大鼠胰腺移植細胞情況。 結(jié)果: (1)48h后可見散在貼壁細胞,形態(tài)呈成纖維樣,72h后通過全量換液去除殘留的各種血細胞,貼壁生長的MSCs呈單個分散存在或形成幾個細胞的克隆,7~10天后,貼壁
10、細胞數(shù)目明顯增多,呈梭形或長多邊形,形態(tài)不完全均一,但細胞排列整齊,邊界清晰,在培養(yǎng)瓶中分布及生長均勻。原代培養(yǎng)10~14天細胞可達80~90%融合,0.25%胰蛋白酶常規(guī)消化,按1:2的比例傳代,傳代后的BM-MSCs形態(tài)與原代基本相似,經(jīng)過3代后BM-MSCs基本達到形態(tài)均一。流式細胞術(shù)細胞表型的鑒定分析顯示BM-MSCs高表達CD44、CD90,而CD34、CD45、MHCI低表達或表達陰性,誘導(dǎo)分化實驗表明BM-MSCs在體外具
11、有向中胚層3種細胞(骨、軟骨和脂肪細胞)及外胚層細胞(神經(jīng)細胞)分化的能力,表明我們分離培養(yǎng)的BM-MSCs為具有均一細胞表面特征的細胞群,是一群區(qū)別于造血干細胞(hematopoietic stem cells,HSCs)并具有多向分化潛能的非定向干細胞。 (2)BrdU標記的BM-MSCs免疫熒光染色后可見細胞核為DAPI/BrDu雙染,即藍/綠雙染,標記陽性率89.5%。臺盼藍染色測定BrdU標記后細胞活率,可見標記后細胞
12、活率99%±0.6%。Wistar大鼠按60 mg/kg體重尾靜脈注射1%STZ溶液,造模成功率為22/25。實驗過程中,正常對照組血糖保持在(4.6±0.7~5.6±1.0)mmol/L,DM對照組血糖在(24.2±2.3~27.8±2.1)mmol/L,實驗組血糖在(17.7±3.9~26.1±3.2)mmol/L。其中,在BM-MSCs移植后,實驗組較DM對照組血糖有下降趨勢,尤其在第45天時,實驗組較DM對照組血糖明顯降低(17
13、.7 mmol/L±3.9 vs 27.8 mmol/L±2.1,P<0.05)。各時間點,實驗組、DM對照組血糖均高于正常組(均P<0.05)。在體重方面,正常對照組體重逐漸增加,DM對照組體重降低,而實驗組體重變化不明顯;在第45天時,DM對照組較正常對照組體重明顯降低(133.3g±13.1 vs.358.8g±21.6,P<0.05);另外,實驗組較DM對照組體重亦顯著增加(232.7 g±19.7 vs 133.3g±13.1
14、,P<0.05)。在第45天時實驗結(jié)束時,各組血漿胰島素水平存在差異。其中,DM對照組較正常對照組血漿胰島素水平明顯降低(10.3mIU/ml±2.3 vs。33.2mIU/ml±3.8,P<0.05);實驗組較DM對照組血漿胰島素水平則顯著增加(19.8 mIU/ml±4.8 vs 10.3mIU/ml±2.3,P<0.05)。各組胰腺組織免疫組織化學(xué)染色觀察結(jié)果顯示,與DM對照組比較,實驗組胰島易見,體積小、多數(shù)位于導(dǎo)管附近,提示多
15、為來源于胰腺導(dǎo)管上皮的新生胰島,與正常對照組胰島比較,實驗組單個新生胰島面積和直徑均明顯小于正常對照組(P<0.05)。另外,實驗組免疫熒光雙標記染色結(jié)果顯示,BrdU標記的BM-MSCs移植后可在胰腺組織中出現(xiàn),多分布在胰腺導(dǎo)管周圍,細胞核呈綠色熒光,提示有BM-MSCs歸巢于胰腺;同時,可觀察到少數(shù)綠色細胞核、紅色細胞漿的雙染細胞,說明這種細胞為移植的BM-MSCs,且能夠分泌胰島素,提示有少量歸巢于胰腺的BM-MSCs轉(zhuǎn)分化為胰島
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