Rb-,1-、Rg-,1-對腎缺血再灌注血清誘導(dǎo)HK-2細胞凋亡模型中Bcl-2、Bax表達的影響.pdf

1、目的： 1．建立腎缺血再灌注血清誘導(dǎo)人近曲腎小管上皮細胞(HK-2)凋亡模型； 2．探討人參皂甙Rb1、Rg1對此模型中Bcl-2、Bax表達的影響及其可能機制。 方法： (1)以HK-2細胞作為研究對象。 (2)腎缺血再灌注血清的制備家兔左側(cè)腎動脈夾閉1h，松開動脈夾再灌注30min，腎靜脈插管取血，室溫下靜置0.5h，3000r/min離心10min吸取血清，過濾除菌，制備腎缺血再灌注血清(S

2、IR)，4℃冰箱儲存?zhèn)溆?。對照組除不夾閉腎動脈外，其余處理同IR組，制備對照組兔血清(SC)。 (3)建立腎缺血再灌注血清誘導(dǎo)HK-2細胞凋亡模型分別用含不同濃度SC或SIR的DMEM培養(yǎng)液與HK-2細胞共培養(yǎng)24h，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法篩選腎缺血再灌注血清的最適作用濃度，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移(TUNEL)法檢測腎缺血再灌注血清誘導(dǎo)HK-2細胞凋亡，建立腎缺血再灌注血清誘導(dǎo)HK-2細胞凋亡模型。實驗分為對照組(SC終濃度分

3、別為1％、5％、10％、15％、20％、40％)和缺血再灌注組(SIR終濃度分別為1％、5％、10％、15％、20％、40％)。 (4)人參皂甙Rb1、Rg1干預(yù)的最適作用濃度20％SIR(最適血清濃度)加不同濃度人參皂甙Rb1或人參皂甙Rg1的DMEM培養(yǎng)液與HK-2細胞共培養(yǎng)24h，MTT法篩選人參皂甙Rb1、Rg1的最適藥物濃度。實驗分為對照組(20％SC)、缺血再灌注組(20％SIR)、人參皂甙Rb1干預(yù)組(20％SIR

4、+Rb1)和人參皂甙Rg1干預(yù)組(20％SIR+Rg1)；人參皂甙Rb1干預(yù)組的Rb1終濃度分別為20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、lOOmg/L、120mg/L、140mg/L；人參皂甙Rg1干預(yù)組的Rg1終濃度分別為20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L、120mg/L、140mg/L。 (5)Bcl-2、Bax檢測實驗分為對照組(20％SC)、缺血再灌注組(20％SIR

5、)、人參皂甙Rb1干預(yù)組(20％SIR+80mg/LRb1) 和人參皂甙Rg1 干預(yù)組(20％SIR+80mg/LRg1)。常規(guī)培養(yǎng)24h后，用免疫細胞化學(xué)法檢測Bcl-2、Bax的表達，并用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對圖像進行分析。 (6)統(tǒng)計學(xué)處理各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±S)表示，樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析和配對t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： (1)鏡下觀

6、察到對照組細胞呈鋪路石樣，貼壁生長，而缺血再灌注組細胞受損明顯，形態(tài)不呈上皮樣，細胞之間連接松散，在缺血再灌注血清濃度為20％時細胞損傷明顯。 (2)缺血再灌注血清的最適作用濃度缺血再灌注組和對照組的OD值在血清濃度為10％時達到最大值，40％時達到最小值。TUNEL法進一步檢測腎缺血再灌注血清誘導(dǎo)HK-2細胞凋亡模型的建立時發(fā)現(xiàn)，20％SIR組的IOD值大于20％SC組(P=0.006<0.05)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

7、 (3)人參皂甙Rb1、Rg1的最適藥物濃度隨著藥物濃度增加，OD值先增大后減小。60mg/L、80mg/L和100mg/L的Rb1干預(yù)組和60mg/L、80mg/L和100mg/L的Rg1干預(yù)組的OD值較20％SIR組增大，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。80mg/LRb1干預(yù)組(0.2463±0.0046)和80mg/LRg1干預(yù)組(0.2451±0.0048)的OD值均達到最大值。 (4)免疫細胞化學(xué)法檢測缺血再灌注

8、組、Rb1干預(yù)組及Rg1干預(yù)組Bcl-2、Bax的表達均較對照組顯著增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Rb1干預(yù)組和Rg1干預(yù)組Bcl-2表達均高于缺血再灌注組，但差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；Rb1干預(yù)組和Rg1干預(yù)組Bax表達均低于缺血再灌注組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Rb1干預(yù)組(5.948)和Rg1干預(yù)組(5.342)Bcl-2/Bax比值均高于缺血再灌注組(2.442)。 結(jié)論：人參皂甙R