肝移植缺血再灌注損傷對肝、腎、小腸組織細胞凋亡及Bcl-2、Fas基因表達影響的實驗研究.pdf

1、研究背景 肝移植作為終末期肝病的唯一有效治療手段正得到廣泛的應用，其技術也日益成熟，病人術后5年存活率達到70％以上。隨著高效、強力免疫抑制劑的廣泛應用，急性排斥反應的發(fā)生率已明顯降低，影響肝移植術后早期存活的主要因素越來越集中在肝臟、腎臟、小腸的功能損害方面，肝移植術后病人并發(fā)移植肝無功能、急性腎功能衰竭、小腸損傷而加重的內(nèi)毒素血癥使病人術后死亡率明顯增加。 原位肝移植手術技術復雜，經(jīng)歷供肝切取、供肝修整和受體手術三個

2、階段。在受體手術中，門靜脈和下腔靜脈需要阻斷，恢復血流后肝臟、腎和小腸要經(jīng)歷缺血再灌注損傷。而缺血再灌注損傷是肝移植術后病人并發(fā)移植肝無功能、急性腎功能衰竭、小腸損傷而加重的內(nèi)毒素血癥的重要因素。細胞凋亡是缺血再灌注損傷早期肝細胞死亡的主要方式，許多基因參與了細胞凋亡的調(diào)控，其中目前研究最多，認為最主要的調(diào)控基因為Bcl-2基因及Fas基因。目前研究熱點主要集中在缺血再灌注損傷前后肝臟的細胞凋亡及干預方面，對于肝臟組織在肝移植術后多長時

3、間達到細胞凋亡高峰國內(nèi)外有不同的研究結(jié)果。另外，在原位肝移植手術中，受體大鼠肝臟切除、供肝植入階段需要阻斷門靜脈及下腔靜脈，此時腎臟及小腸的動脈血供無明顯變化，但是靜脈回流明顯受阻，出現(xiàn)腎臟及小腸器官淤血。當門靜脈及下腔靜脈吻合完畢，再次開放時，腎臟及小腸組織靜脈回流恢復，淤血得以解除。這一種形式的缺血再灌注損傷稱之為“淤血再灌注損傷”似乎更為準確，與肝臟所經(jīng)歷的動脈缺血后引發(fā)的缺血再灌注損傷相比，其對機體的損傷較輕。對于腎臟及小腸在肝

4、移植“淤血再灌注損傷”前后的細胞凋亡及基因調(diào)控方面的變化規(guī)律尚未有相關的文獻報道。本文通過研究原位肝移植缺血再灌注損傷后移植肝、腎臟及小腸組織中的細胞凋亡的變化規(guī)律，同時研究Bcl-2和Fas基因表達在損傷細胞中的動態(tài)變化規(guī)律，并探討細胞凋亡和Bcl-2、Fas基因表達存在的內(nèi)在相互關系，進一步闡述移植肝無功能、急性腎功能衰竭、小腸損傷而加重的內(nèi)毒素血癥的發(fā)生機制。無論是在實驗研究還是在臨床上的治療方面具有指導意義。 目的：

5、 (1)探討建立穩(wěn)定的大鼠原位肝移植模型的方法，觀察Wistard→Wistard大鼠模型的穩(wěn)定性及是否符合實驗要求，從而建立適宜、可靠的大鼠原位肝移植模型。 (2)對比研究大鼠肝移植實驗組及對照組的肝、腎臟及小腸組織中的細胞凋亡變化規(guī)律。 (3)對比研究大鼠肝移植實驗組及對照組的肝、腎臟及小腸Bcl-2、Fas基因表達的變化規(guī)律，探討其可能的發(fā)生機制。 方法： (1)參照Kamada“二袖套法”，加

6、以適當改進，建立Wistard→Wistard大鼠原位肝移植動物模型，并以假手術組大鼠為對照組。測定兩組術后1、3、6、12、24小時血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)水平變化。 (2)實驗組及對照組大鼠分別于術后1、3、6、12、24小時時分別處死，獲取肝臟、腎臟及小腸組織，對相應的標本進行病理學檢查。應用免疫組化(SP)法檢測肝臟、腎臟及小腸組織中凋亡細胞在術后不同時間點的Fa

7、S蛋白表達，應用細胞流式技術及電鏡技術對術后不同時間點的肝臟、腎臟及小腸組織中凋亡細胞進行定性及定量分析。 (3)應用逆轉(zhuǎn)錄法(RT-PCR法)檢測肝臟、腎臟及小腸組織中Bcl-2和Fas基因表達在術后不同時間點的表達變化規(guī)律。 以上數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，以SPSS軟件進行統(tǒng)計學分析，P＜0.05為差異有顯著性。 結(jié)論： (1)運用改良Kamada二袖套法建立穩(wěn)定而確切的Wistard→Wistard大

8、鼠的原位肝移植模型是可行的。 (2)肝移植缺血再灌注可致移植肝、腎和小腸損傷，尤其肝、腎功能損傷明顯，其改變也最顯著： (3)肝移植缺血再灌注損傷可致肝、腎和小腸細胞凋亡，術后1小時即明顯增加，其后逐漸增高，至術后12小時至最高。肝臟的細胞凋亡率最高，小腸的細胞凋亡率最低。 (4)細胞凋亡是肝移植缺血再灌注損傷后腎臟及小腸細胞早期死亡的主要形式。 (5)肝移植缺血再灌注損傷導致肝、腎臟及小腸組織Bcl-2