慢病毒介導的親環(huán)素A(CyPA)siRNA對非小細胞肺癌抑制作用的實驗研究.pdf

1、肺癌是常見的惡性腫瘤,被認為是對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。全球每年新增120萬病例,中國每年有60萬人死于肺癌,在中國肺癌5年生存率僅8.9％,非小細胞肺癌占肺癌的85％以上,而非小細胞肺癌中85％以上又都屬中晚期肺癌而失去根治性手術治療的機會。肺癌的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結果,多種基因在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中均起到了非常重要的作用,蛋白組學的發(fā)展使得在非小細胞肺癌(Non-small celllung cancer

2、,NSCLC)發(fā)現了許多高表達和低表達蛋白,親環(huán)素A(Cyclophilin A,CyPA)就是眾多相關蛋白之一。CyPA是本課題組應用雙向電泳技術(2-DE)在肺腺鱗癌組織中發(fā)現的特異性高表達的差異蛋白,CyPA是功能相關的蛋白家族成員之一,具有肽基脯氨基順反異構酶活性,能催化細胞內蛋白質的折迭、裝配和運輸,起分子伴侶的作用。新近研究表明,CyPA參與了許多癌的發(fā)生和發(fā)展過程,其促進癌細胞生長的作用在胰腺癌研究中,取得了很有說服力的結

3、果。RNA干擾(RNAi)技術具有快速、高效、易行的特點,在基因功能研究、基因治療方面顯示了巨大的前景。慢病毒載體介導的短發(fā)夾RNA(shRNA)表達載體能感染非分裂細胞和終末分化細胞,并且在感染后整合到宿主細胞的基因組,進行長時間的穩(wěn)定表達,適合體內實驗研究。
　　研究目的：1.假設特異性地沉默CyPA基因可能是抑制非小細胞肺癌生長的有效方法,為此,本課題首先構建慢病毒介導的CyPA siRNA系統(tǒng)。2.本課題旨在研究CyPA在

4、NSCLC發(fā)生中的作用,以尋求其作為基因治療新靶點的依據。因此,采用慢病毒介導的CyPA siRNA,分別在體內體外水平研究CyPA基因沉默對非小細胞肺癌細胞生長的抑制作用,對已篩選的肺癌相關蛋白CyPA的基因進行生物學功能研究。
　　材料與方法：1.CyPA mRNA和蛋白在NSCLC細胞和組織的表達水平1.1采用雙鏈嵌合熒光染料SYBR GreenⅠ熒光定量PCR技術,設計特異性引物,提取NSCLC A549、H1299及人正

5、常支氣管上皮細胞BEAS-2B細胞的總RNA,反轉錄獲得cDNA進行PCR,低熔點瓊脂糖凝膠回收純化PCR擴增產物,取1μl的純化產物,作10倍系列稀釋共9個梯度,取后6個稀釋梯度的模板做標準曲線,分別建立內對照β-actin和目的基因CyPA定量標準曲線。檢測A549、H1299及BEAS-2B細胞CyPAmRNA的表達水平,以BEAS-2B細胞作為對照,用2-ΔΔCt計算CyPAmRNA相對表達量,通過PCR產物的熔解曲線評價其特異

6、性。1.2收集45例NSCLC手術病人切除的肺癌組織,22例對應的癌旁組織,33例對應的正常肺組織制成組織芯片,其中鱗癌25例,腺癌20例;按TNM分期標準Ⅰ+Ⅱ期27例,Ⅲ期18例,用SP免疫組化方法和組織芯片技術,觀察CyPA在NSCLC癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達和分布情況以及與臨床病理指標的關系。2.構建并篩選慢病毒介導的CyPA siRNA有效靶點和制備病毒顆粒2.1首先設計并合成4對CyPA基因siRNA靶序列寡核苷酸

7、,退火形成雙鏈DNA,與經HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP載體連接產生Lv-shCyPA慢病毒質粒載體,PCR及測序篩選鑒定陽性克隆。2.2將陽性克隆Lv-shCyPA慢病毒質粒載體與pHelper1.0和pHelper2.0質粒共轉染293T細胞,包裝制備5個假包裝病毒顆粒(Lv-shCyPA)并感染NSCLC A549、H1299細胞,Western Blot分析CyPA蛋白表達水平,篩選CyPA siRNA有效靶點并進行

8、該靶點高滴度病毒包裝,命名為Lv-shCyPA。2.3待A549、H1299細胞生長至50％~70％融合度時,將Lv-shCyPA分別按照MOI值為2、5、10、20、40感染A549細胞、H1299,根據表達熒光的細胞百分數優(yōu)化MOI值。3.慢病毒介導的CyPA siRNA對A549、H1299細胞生長的體外研究3.1待A549、H1299細胞生長至50％~70％融合度時,按照優(yōu)化的MOI值,加入適量的病毒,每孔細胞加Polybern

9、e(5μg/ml),正常培養(yǎng)傳代4~5次,以GFP為報告基因鏡下篩選GFP強表達的克隆,分離培養(yǎng),建立了CyPA穩(wěn)定沉默的細胞系A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA。3.2將Lv-shCyPA分別按照A549細胞(MOI=20)、H1299(MOI=5)感染NSCLC A549、H1299細胞,感染第5天提取細胞總RNA,采用熒光定量RT-PCR檢測CyPA mRNA表達水平。3.3取對數生長期的CyPA穩(wěn)定沉默

10、的細胞系A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA,胰酶消化后重懸成2×104/ml的細胞懸液,每孔接種100μl于96孔板,分別在培養(yǎng)1d、2d、3d、4d、5d、6d時終止培養(yǎng),MTT法檢測細胞增殖情況。3.4將Lv-shCyPA按照A549細胞(MOI=20)、H1299(MOI=5)感染A549、H1299細胞,用不含EDTA的0.25％胰酶消化感染第5天的細胞培養(yǎng)物,4℃70％乙醇固定細胞,加1mlPI(50

11、μg/ml)染色,4℃避光30min,進行細胞周期及凋亡檢測。3.5陰性對照病毒顆粒按上述步驟進行平行實驗,未感染病毒的A549、H1299分別作為實驗對照組。4.慢病毒介導的CyPA siRNA對A549、H1299細胞裸鼠移植瘤生長的作用4.1 A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA細胞懸液(5×107/ml),注射于裸鼠協腹皮下,每組5~6只裸鼠,注射體積為100μl/只。4.2裸鼠成瘤后每四天測量1次移植瘤

12、體積,從注射起測量到第38d,腫瘤體積=(長×寬2)×0.5,根據移植瘤體積繪制移植瘤生長曲線。4.3陰性對照病毒顆粒感染的A549、H1299按上述步驟進行致瘤,未感染病毒的A549、H1299分別作為實驗對照組。5.統(tǒng)計學處理利用SPSS12.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析,采用t檢驗對不同感染條件下細胞CyPA蛋白、mRNA、細胞增殖率、細胞周期分布、凋亡率以及裸鼠移植瘤瘤體、重量與對照組比較;秩和檢驗比較不同組織CyPA蛋白表達水平的

13、差異,以α=0.05為檢驗水準。
　　結果：1.CyPA mRNA和蛋白在NSCLC細胞和組織的表達水平1.1熒光定量RT-PCR檢測A549、H1299、BEAS-2B細胞中CyPA mRNA的表達水平,結果顯示:肺腺癌細胞A549、H1299中CyPA mRNA呈高表達,其表達水平與BEAS-2B細胞相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。1.2組織芯片免疫組織化學技術檢測,結果顯示:CyPA蛋白的陽性信號見于肺癌細胞漿、肺泡

14、上皮細胞漿,呈棕色顆粒狀,其分布以廣泛性表達為主,偶見局灶性或散在性分布;正常肺組織未見或少見棕色顆粒沉著。NSCLC癌組織及癌旁組織中CyPA的表達水平明顯高于正常肺組織中CyPA蛋白的表達水平,其差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),CyPA蛋白在正常組織、癌旁組織及肺癌組織中的陽性表達率分別為9.09％(3/33)、53.62％(12/22)、82.22％(37/45),CyPA在正常組織、癌旁組織及肺癌組織中的表達水平依次呈遞增趨勢

15、;肺腺癌與肺鱗癌組織中CyPA蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);不同TNM分期的的癌組織CyPA蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。2.慢病毒介導的CyPA siRNA的有效靶點有效的CyPA siRNA靶序列是5’-GTGAAAGAAGGCATGAATA-3’,根據該序列制備的CyPA siRNA假包裝病毒顆粒滴度為2×109TU/ml。3.慢病毒介導的CyPA siRNA對A549、H1299中CyPA基因

16、的沉默作用Lv-shCyPA感染A549、H1299細胞,CyPA mRNA和蛋白表達水平均下降,與對照組相比,CyPA mRNA相對表達量分別為0.048和0.1452,CyPA mRNA的沉默效率分別為95.2％和85.48％,CyPA蛋白水平相對表達量分別為13.48％和14.7％,其表達抑制效率分別為86.52％和85.3％,CyPA mRNA與蛋白的表達水平具有一致性,其表達水平與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

17、陰性對照A549/NC、H1299/NC組CyPA mRNA和蛋白的表達水平與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。4.慢病毒介導的CyPA siRNA對A549、H1299細胞生長的抑制作用MTT法分析不同條件下A549、H1299細胞的生長狀態(tài),結果顯示:A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA細胞生長明顯平緩,感染第5d細胞增殖率下降,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。流式細胞術分析不同條件下細胞

18、各周期分布,結果顯示:不同條件下細胞G0-G1期、S期細胞比例與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA細胞G2-M期細胞相對減少,細胞凋亡率增加,與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而A549/NC、H1299/NC組G2-M期比例、細胞凋亡率與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。5.慢病毒介導的CyPA siRNA對A549、H1299細胞裸鼠移植

19、瘤生長的抑制作用未感染病毒組及陰性對照病毒顆粒感染組的細胞接種裸鼠后,移植瘤在第4d出現可見腫瘤,然后生長迅速,而A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA感染組可見腫瘤在接種后6d出現,移植瘤生長明顯遲緩。接種后第38d,A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA組移植瘤體積小、重量輕,與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),CyPA基因沉默組移植瘤瘤體重量平均降低了77.76％和78.85

20、％。而A549/NC、H1299/NC組細胞接種后形成的移植瘤體積、重量與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　結論：1.CyPA蛋白在正常肺組織、NSCLC癌旁組織及癌組織中的表達水平依次呈遞增趨勢,尤其是在癌組織中呈高表達水平;同時在NSCLC A549、H1299細胞中CyPA mRNA亦呈高表達水平,CyPA mRNA的表達水平與BEAS-2B細胞相比差異有統(tǒng)計學意義,提示CyPA可能參與了非小細胞肺癌的發(fā)生