慢病毒介導(dǎo)的親環(huán)素A(CyPA)siRNA對(duì)非小細(xì)胞肺癌抑制作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肺癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤,被認(rèn)為是對(duì)人類(lèi)健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。全球每年新增120萬(wàn)病例,中國(guó)每年有60萬(wàn)人死于肺癌,在中國(guó)肺癌5年生存率僅8.9％,非小細(xì)胞肺癌占肺癌的85％以上,而非小細(xì)胞肺癌中85％以上又都屬中晚期肺癌而失去根治性手術(shù)治療的機(jī)會(huì)。肺癌的發(fā)生是環(huán)境因素和遺傳因素共同作用的結(jié)果,多種基因在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中均起到了非常重要的作用,蛋白組學(xué)的發(fā)展使得在非小細(xì)胞肺癌(Non-small celllung cancer

2、,NSCLC)發(fā)現(xiàn)了許多高表達(dá)和低表達(dá)蛋白,親環(huán)素A(Cyclophilin A,CyPA)就是眾多相關(guān)蛋白之一。CyPA是本課題組應(yīng)用雙向電泳技術(shù)(2-DE)在肺腺鱗癌組織中發(fā)現(xiàn)的特異性高表達(dá)的差異蛋白,CyPA是功能相關(guān)的蛋白家族成員之一,具有肽基脯氨基順?lè)串悩?gòu)酶活性,能催化細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折迭、裝配和運(yùn)輸,起分子伴侶的作用。新近研究表明,CyPA參與了許多癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程,其促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用在胰腺癌研究中,取得了很有說(shuō)服力的結(jié)

3、果。RNA干擾(RNAi)技術(shù)具有快速、高效、易行的特點(diǎn),在基因功能研究、基因治療方面顯示了巨大的前景。慢病毒載體介導(dǎo)的短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)載體能感染非分裂細(xì)胞和終末分化細(xì)胞,并且在感染后整合到宿主細(xì)胞的基因組,進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定表達(dá),適合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。
　　研究目的：1.假設(shè)特異性地沉默CyPA基因可能是抑制非小細(xì)胞肺癌生長(zhǎng)的有效方法,為此,本課題首先構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的CyPA siRNA系統(tǒng)。2.本課題旨在研究CyPA在

4、NSCLC發(fā)生中的作用,以尋求其作為基因治療新靶點(diǎn)的依據(jù)。因此,采用慢病毒介導(dǎo)的CyPA siRNA,分別在體內(nèi)體外水平研究CyPA基因沉默對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用,對(duì)已篩選的肺癌相關(guān)蛋白CyPA的基因進(jìn)行生物學(xué)功能研究。
　　材料與方法：1.CyPA mRNA和蛋白在NSCLC細(xì)胞和組織的表達(dá)水平1.1采用雙鏈嵌合熒光染料SYBR GreenⅠ熒光定量PCR技術(shù),設(shè)計(jì)特異性引物,提取NSCLC A549、H1299及人正

5、常支氣管上皮細(xì)胞BEAS-2B細(xì)胞的總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA進(jìn)行PCR,低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,取1μl的純化產(chǎn)物,作10倍系列稀釋共9個(gè)梯度,取后6個(gè)稀釋梯度的模板做標(biāo)準(zhǔn)曲線,分別建立內(nèi)對(duì)照β-actin和目的基因CyPA定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測(cè)A549、H1299及BEAS-2B細(xì)胞CyPAmRNA的表達(dá)水平,以BEAS-2B細(xì)胞作為對(duì)照,用2-ΔΔCt計(jì)算CyPAmRNA相對(duì)表達(dá)量,通過(guò)PCR產(chǎn)物的熔解曲線評(píng)價(jià)其特異

6、性。1.2收集45例NSCLC手術(shù)病人切除的肺癌組織,22例對(duì)應(yīng)的癌旁組織,33例對(duì)應(yīng)的正常肺組織制成組織芯片,其中鱗癌25例,腺癌20例;按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ+Ⅱ期27例,Ⅲ期18例,用SP免疫組化方法和組織芯片技術(shù),觀察CyPA在NSCLC癌組織、癌旁組織及正常組織中的表達(dá)和分布情況以及與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。2.構(gòu)建并篩選慢病毒介導(dǎo)的CyPA siRNA有效靶點(diǎn)和制備病毒顆粒2.1首先設(shè)計(jì)并合成4對(duì)CyPA基因siRNA靶序列寡核苷酸

7、,退火形成雙鏈DNA,與經(jīng)HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP載體連接產(chǎn)生Lv-shCyPA慢病毒質(zhì)粒載體,PCR及測(cè)序篩選鑒定陽(yáng)性克隆。2.2將陽(yáng)性克隆Lv-shCyPA慢病毒質(zhì)粒載體與pHelper1.0和pHelper2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,包裝制備5個(gè)假包裝病毒顆粒(Lv-shCyPA)并感染NSCLC A549、H1299細(xì)胞,Western Blot分析CyPA蛋白表達(dá)水平,篩選CyPA siRNA有效靶點(diǎn)并進(jìn)行

8、該靶點(diǎn)高滴度病毒包裝,命名為L(zhǎng)v-shCyPA。2.3待A549、H1299細(xì)胞生長(zhǎng)至50％~70％融合度時(shí),將Lv-shCyPA分別按照MOI值為2、5、10、20、40感染A549細(xì)胞、H1299,根據(jù)表達(dá)熒光的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)優(yōu)化MOI值。3.慢病毒介導(dǎo)的CyPA siRNA對(duì)A549、H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的體外研究3.1待A549、H1299細(xì)胞生長(zhǎng)至50％~70％融合度時(shí),按照優(yōu)化的MOI值,加入適量的病毒,每孔細(xì)胞加Polybern

9、e(5μg/ml),正常培養(yǎng)傳代4~5次,以GFP為報(bào)告基因鏡下篩選GFP強(qiáng)表達(dá)的克隆,分離培養(yǎng),建立了CyPA穩(wěn)定沉默的細(xì)胞系A(chǔ)549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA。3.2將Lv-shCyPA分別按照A549細(xì)胞(MOI=20)、H1299(MOI=5)感染NSCLC A549、H1299細(xì)胞,感染第5天提取細(xì)胞總RNA,采用熒光定量RT-PCR檢測(cè)CyPA mRNA表達(dá)水平。3.3取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CyPA穩(wěn)定沉默

10、的細(xì)胞系A(chǔ)549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA,胰酶消化后重懸成2×104/ml的細(xì)胞懸液,每孔接種100μl于96孔板,分別在培養(yǎng)1d、2d、3d、4d、5d、6d時(shí)終止培養(yǎng),MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。3.4將Lv-shCyPA按照A549細(xì)胞(MOI=20)、H1299(MOI=5)感染A549、H1299細(xì)胞,用不含EDTA的0.25％胰酶消化感染第5天的細(xì)胞培養(yǎng)物,4℃70％乙醇固定細(xì)胞,加1mlPI(50

11、μg/ml)染色,4℃避光30min,進(jìn)行細(xì)胞周期及凋亡檢測(cè)。3.5陰性對(duì)照病毒顆粒按上述步驟進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),未感染病毒的A549、H1299分別作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。4.慢病毒介導(dǎo)的CyPA siRNA對(duì)A549、H1299細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的作用4.1 A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA細(xì)胞懸液(5×107/ml),注射于裸鼠協(xié)腹皮下,每組5~6只裸鼠,注射體積為100μl/只。4.2裸鼠成瘤后每四天測(cè)量1次移植瘤

12、體積,從注射起測(cè)量到第38d,腫瘤體積=(長(zhǎng)×寬2)×0.5,根據(jù)移植瘤體積繪制移植瘤生長(zhǎng)曲線。4.3陰性對(duì)照病毒顆粒感染的A549、H1299按上述步驟進(jìn)行致瘤,未感染病毒的A549、H1299分別作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用SPSS12.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用t檢驗(yàn)對(duì)不同感染條件下細(xì)胞CyPA蛋白、mRNA、細(xì)胞增殖率、細(xì)胞周期分布、凋亡率以及裸鼠移植瘤瘤體、重量與對(duì)照組比較;秩和檢驗(yàn)比較不同組織CyPA蛋白表達(dá)水平的

13、差異,以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1.CyPA mRNA和蛋白在NSCLC細(xì)胞和組織的表達(dá)水平1.1熒光定量RT-PCR檢測(cè)A549、H1299、BEAS-2B細(xì)胞中CyPA mRNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:肺腺癌細(xì)胞A549、H1299中CyPA mRNA呈高表達(dá),其表達(dá)水平與BEAS-2B細(xì)胞相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。1.2組織芯片免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè),結(jié)果顯示:CyPA蛋白的陽(yáng)性信號(hào)見(jiàn)于肺癌細(xì)胞漿、肺泡

14、上皮細(xì)胞漿,呈棕色顆粒狀,其分布以廣泛性表達(dá)為主,偶見(jiàn)局灶性或散在性分布;正常肺組織未見(jiàn)或少見(jiàn)棕色顆粒沉著。NSCLC癌組織及癌旁組織中CyPA的表達(dá)水平明顯高于正常肺組織中CyPA蛋白的表達(dá)水平,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CyPA蛋白在正常組織、癌旁組織及肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為9.09％(3/33)、53.62％(12/22)、82.22％(37/45),CyPA在正常組織、癌旁組織及肺癌組織中的表達(dá)水平依次呈遞增趨勢(shì)

15、;肺腺癌與肺鱗癌組織中CyPA蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);不同TNM分期的的癌組織CyPA蛋白的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。2.慢病毒介導(dǎo)的CyPA siRNA的有效靶點(diǎn)有效的CyPA siRNA靶序列是5’-GTGAAAGAAGGCATGAATA-3’,根據(jù)該序列制備的CyPA siRNA假包裝病毒顆粒滴度為2×109TU/ml。3.慢病毒介導(dǎo)的CyPA siRNA對(duì)A549、H1299中CyPA基因

16、的沉默作用Lv-shCyPA感染A549、H1299細(xì)胞,CyPA mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降,與對(duì)照組相比,CyPA mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.048和0.1452,CyPA mRNA的沉默效率分別為95.2％和85.48％,CyPA蛋白水平相對(duì)表達(dá)量分別為13.48％和14.7％,其表達(dá)抑制效率分別為86.52％和85.3％,CyPA mRNA與蛋白的表達(dá)水平具有一致性,其表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

17、陰性對(duì)照A549/NC、H1299/NC組CyPA mRNA和蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。4.慢病毒介導(dǎo)的CyPA siRNA對(duì)A549、H1299細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用MTT法分析不同條件下A549、H1299細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài),結(jié)果顯示:A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA細(xì)胞生長(zhǎng)明顯平緩,感染第5d細(xì)胞增殖率下降,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)分析不同條件下細(xì)胞

18、各周期分布,結(jié)果顯示:不同條件下細(xì)胞G0-G1期、S期細(xì)胞比例與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA細(xì)胞G2-M期細(xì)胞相對(duì)減少,細(xì)胞凋亡率增加,與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而A549/NC、H1299/NC組G2-M期比例、細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5.慢病毒介導(dǎo)的CyPA siRNA對(duì)A549、H1299細(xì)胞裸鼠移植

19、瘤生長(zhǎng)的抑制作用未感染病毒組及陰性對(duì)照病毒顆粒感染組的細(xì)胞接種裸鼠后,移植瘤在第4d出現(xiàn)可見(jiàn)腫瘤,然后生長(zhǎng)迅速,而A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA感染組可見(jiàn)腫瘤在接種后6d出現(xiàn),移植瘤生長(zhǎng)明顯遲緩。接種后第38d,A549/Lv-shCyPA、H1299/Lv-shCyPA組移植瘤體積小、重量輕,與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CyPA基因沉默組移植瘤瘤體重量平均降低了77.76％和78.85

20、％。而A549/NC、H1299/NC組細(xì)胞接種后形成的移植瘤體積、重量與對(duì)照組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論：1.CyPA蛋白在正常肺組織、NSCLC癌旁組織及癌組織中的表達(dá)水平依次呈遞增趨勢(shì),尤其是在癌組織中呈高表達(dá)水平;同時(shí)在NSCLC A549、H1299細(xì)胞中CyPA mRNA亦呈高表達(dá)水平,CyPA mRNA的表達(dá)水平與BEAS-2B細(xì)胞相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示CyPA可能參與了非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生