鈉泵參與大鼠皮層大錐體細(xì)胞的缺氧性損傷.pdf

1、腦缺氧導(dǎo)致嚴(yán)重的細(xì)胞變性，因而腦功能喪失。當(dāng)前普遍認(rèn)為，缺氧主要導(dǎo)致谷氨酸大量釋放和細(xì)胞內(nèi)過量的Ca2+蓄積，從而引起神經(jīng)元死亡。 鈉泵又稱Na+，K+-ATP酶，是一種膜結(jié)合蛋白，可通過水解一分子ATP將三個Na+轉(zhuǎn)運到細(xì)胞外同時攝取兩個K+進(jìn)入細(xì)胞，產(chǎn)生電化學(xué)梯度，維持細(xì)胞滲透壓平衡和靜息電位，因此鈉泵是維持Na+動態(tài)平衡、體液和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。 本研究旨在選取對缺血較敏感的皮層神經(jīng)元(Ⅴ和Ⅵ層錐體細(xì)胞)，研究鈉泵

2、電生理特性及其在缺氧中的改變，并探討其可能機制。 一、大鼠皮層大錐體細(xì)胞鈉泵的電生理特性 目的：應(yīng)用腦片皮層神經(jīng)元研究鈉泵電流的特性。 方法：選取出生13～16天SD大鼠，深度麻醉后斷頭，快速取出腦組織放入冰冷的人工腦脊液(ACSF)中，取前腦切成300 μm的薄片，儲存在95％O2+5％CO2飽和的ACSF中。然后將制備好的皮層腦片放置于灌流槽中，持續(xù)灌流95％O2和5％CO2飽和的ASCF，流速為1～2ml/

3、min，使腦片浸沒于液面下。在紅外微分干涉相差顯微鏡下，移動電極至細(xì)胞上方負(fù)壓吸引形成封接，再以負(fù)壓吸破細(xì)胞膜，使電極內(nèi)液與細(xì)胞內(nèi)液相通，并將細(xì)胞鉗制在-65mV，當(dāng)膜電流穩(wěn)定時，先通過膜去極化程序(-65mV-0mV--65mV)激活Na+電流來鑒別正在記錄的細(xì)胞是神經(jīng)元，然后換為含不同濃度哇巴因(Oua，10-10～10-3mol/L)的灌流液，以全細(xì)胞膜片鉗方式記錄皮層神經(jīng)元鈉泵電流，并以10-3mol/L Oua產(chǎn)生的泵電流幅度

4、為100％，計算各濃度Oua產(chǎn)生的泵電流(Ip)的變化率(△Ip)，并以此為縱坐標(biāo)，以O(shè)ua濃度(Oua)為橫坐標(biāo)，繪制△Ip-[Oua]關(guān)系曲線。整個實驗在室溫下進(jìn)行結(jié)果：10-3 mol/L Oua引起的膜電流內(nèi)向移動幅度與切換無K+細(xì)胞外液所致的膜電流內(nèi)向移動幅度相同，證明該Oua敏感性電流為鈉泵電流。本研究在53個神經(jīng)元測定了泵電流，根據(jù)神經(jīng)元鈉泵對10-3mol/L Oua。的反應(yīng)，可將鈉泵電流對Oua(10-10～10-3m

5、ol/L)的△Ip-[Oua]關(guān)系曲線分為興奮、抑制和無作用三種模式。三部分細(xì)胞的Na+電流、細(xì)胞直徑和電容沒有差異，均為皮層五六層大錐體細(xì)胞。 結(jié)論：皮層的錐體神經(jīng)元表達(dá)兩種功能不同的鈉泵，即高親和力鈉泵和低親和力鈉泵。 二、鈉泵參與了大鼠皮層大錐體細(xì)胞的缺氧性損傷 目的：比較皮層神經(jīng)元高親和力鈉泵和低親和力鈉泵在缺氧損傷中的作用。 方法：通過無糖低氧液體孵育皮層腦片或者培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元來造成糖氧分離的

6、模型，采用TTC染色評價缺氧0、5、10和15 min對皮層腦片神經(jīng)元活性的影響，采用缺氧后皮層腦片大錐體細(xì)胞膜電流密度的改變(△I/Cm)以及培養(yǎng)皮層神經(jīng)元內(nèi)Ca2+濃度([Ca2+]i)的改變(△Ratio)來評價神經(jīng)元缺氧損傷的程度。 鈉泵對缺氧所致皮層腦片神經(jīng)元膜電流變化的影響：采用Oua 10nmol/L興奮或者抑制高親和力鈉泵，以及Oua 10 μmol/L抑制低親和力鈉泵后，檢測缺氧0、2、4、6、8和10 min

7、時的△I/Cm。 鈉泵對缺氧所致皮層腦片神經(jīng)元[Ca2+]i變化的影響：采用可視化動緣探測系統(tǒng)檢測培養(yǎng)的皮層神經(jīng)元[Ca2+]i和Na+濃度([Na+]i)熒光信號(Fura-2 10 μmol/L和SBFI10μmol/L)，①連續(xù)灌流含Oua(10-9～10-3mol/L)的正常細(xì)胞外液2 min，測定[Ca2+]i和[Na+]i△Ratio。②以O(shè)ua 10nmol/L和10 μmol/L正常細(xì)胞外液預(yù)先處理皮層神經(jīng)元，然

8、后換為含有相同濃度Oua的低氧細(xì)胞外液，連續(xù)記錄10 min，測量0、2、4、6、8和10 min的△Ratio。 缺氧對總鈉泵電流的影響：缺氧400s或600s后，給予10-3mol/L Oua比較皮層腦片大錐體細(xì)胞的鈉泵電流密度。 結(jié)果：TTC染色結(jié)果表明，缺氧腦片活性較正常腦片明顯降低(P<0.01)，缺氧5min下降到正常的72.6％，缺氧10 min下降到正常的67.3％，缺氧15 min下降到正常的65.2％

9、，然而在缺氧5、10和15 min之間互相比較則無明顯改變(P>0.05)。正常條件下，離體皮層腦片大錐體細(xì)胞膜電流水平在10 min內(nèi)幾乎維持不變，但給予低氧灌流液10 min，神經(jīng)元膜電流則逐漸增大，在缺氧0、2、4、6、8和10 min時，其△I/Cm分別為0、-0.015±0.006、-0.026±0.011、-0.031±0.016、-0.041±0.010和-0.055±0.014 pA/pF，呈時間依賴性升高(r=0.99

10、1，P<0.01)，缺氧4 min時膜電流即顯著增大(P<0.01)。單純?nèi)毖蹩擅黠@升高大錐體細(xì)胞[Ca2+]i，且呈時間依賴性(r=0.973，P<0.01)，缺氧0、2、4、6、8和10 min時的△Ratio值分別為0、0.019±0.001、0.048±0.006、0.089±0.008、0.130±0.015和0.165±0.008，與缺氧0min比較，4、6、8和10min有明顯差異(P<0.05或0.01)。給予Oua 1

11、0 μmol/L后大錐體細(xì)胞膜電流明顯增大(P<0.01)，此時再缺氧10 min可使膜電流進(jìn)一步呈時間依賴性增大(r=0.9082，P<0.01)，于缺氧2、4、6、8和10 min時△I/Cm即明顯大于缺氧前(0 min)(P<0.05或0.01)，也明顯大于單純?nèi)毖醺鲿r間點(P<0.05或0.01)。 但在具有高親和力興奮性位點的大錐體細(xì)胞，給予Oua 10 nmol/L后再缺氧2、4、6、8和10min，其△I/Cm較缺

12、氧前(0min)均無明顯改變，與單純?nèi)毖醺鲿r間點比較，缺氧4、6、8和10 min時其△I/Cm的增加程度也明顯減小(P<0.05或0.01)，表明高親和力鈉泵興奮，可保護(hù)皮層神經(jīng)元對抗缺氧性損傷。而在僅具有高親和力抑制性位點的大錐體細(xì)胞，給予Oua 10 nmol/L后再缺氧10 min可使膜電流進(jìn)一步呈時間依賴性逐漸增大(r=0.956，P<0.01)，缺氧2、4、6、8和10min，△I/Cm分別較缺氧前(0min)明顯增大(P<

13、0.01)，與單純?nèi)毖醺鲿r間點比較，缺氧4、6、8和10 min時其△I/Cm增加的程度一致(P>0.05)，表明高親和力鈉泵抑制并不影響皮層大錐體細(xì)胞的缺氧損傷。若將此兩組細(xì)胞綜合在一起統(tǒng)計，可發(fā)現(xiàn)Oua 10 nmol/L仍然對缺氧損傷有明顯的保護(hù)作用，與單純?nèi)毖醺鲿r間點比較，缺氧8和10 min時其△I/Cm增加的程度明顯減小(P<0.05或0.01)。 結(jié)論：缺氧使皮層五六層大錐體細(xì)胞膜電流增加以及[Ca2+]i升高。不

14、同程度阻斷鈉泵功能可通過升高皮層大錐體細(xì)胞[Na+]i水平影響[Ca2+]i。興奮高親和力鈉泵對皮層大錐體細(xì)胞的缺氧損傷有保護(hù)作用。阻斷低親和力鈉泵，促進(jìn)了皮層大錐體細(xì)胞缺氧損傷程度。 三、ATP和H2O2對正常或缺氧神經(jīng)元鈉泵的影響 目的：研究皮層大錐體細(xì)胞缺氧損傷中，ATP和H2O2對高、低親和力鈉泵的影響。 方法：ATP對鈉泵的影響：將腦片分為兩組，一組使用正常電極內(nèi)液，一組使用無ATP電極內(nèi)液，每組腦片再

15、分成兩部分，一部分腦片灌流有Oua，(從低濃度到高濃度10-10～10-3mol/L)的正常灌流液，計算鈉泵電流的大小(IP)；另一部分腦片先給予低氧灌流液200 s，再切換為含有Oua(10-10～10-3 mol/L)的低氧灌流液200 s，計算鈉泵電流的大小(IP')。以10-3 mol/L Oua測定的IP或IP'作為1，繪制量效曲線。因此總共4組，分別稱為control-ATP、hypoxia-ATP、control-no A

16、TP和hypoxia-no ATP。 H2O2對鈉泵的影響：先給予含100或300μmol/L H2O2的灌流液200 s，再切換為同時含H2O2和Oua(10-10～10-3 mol/L)的灌流液到平衡，兩部分細(xì)胞分別以10-3 mol/L Oua測定的IP為1，繪制量效曲線。 鈉泵α亞基轉(zhuǎn)位：腦片缺氧10 min或者分別用100或300μmol/L的H2O2孵育10 min，提取總蛋白和膜蛋白，采用western b