斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因的擴(kuò)增、測序,和cytb基因在斯氏貍殖吸蟲不同蟲期的表達(dá).pdf

1、目的:擴(kuò)增出斯氏貍殖吸蟲線粒體 cytb基因片段并測序,研究斯氏貍殖吸蟲5個(gè)蟲期線粒體 cytb基因的表達(dá)情況并分析對(duì)吸蟲研究的作用。
　　方法:(1)分別提取斯氏貍殖吸蟲囊蚴、30天童蟲、60天童蟲、成蟲、蟲卵的mRNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA保存于-20℃。(2)用日本血吸蟲線粒體cytb基因設(shè)計(jì)出斯氏貍殖吸蟲的線粒體cytb基因的兼并引物,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法擴(kuò)增出斯氏貍殖吸蟲cytb基因片段→電泳分離→提純→連接→轉(zhuǎn)化→

2、挑菌→搖菌→送出測序。用所得的測序結(jié)果設(shè)計(jì)斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因片段的特異引物。(3)用DNAsis等軟件分析7種吸蟲的線粒體cytb基因,并用樹的方式表達(dá)它們的親緣關(guān)系。(4)以5個(gè)蟲期cDNA為模板,特異引物為實(shí)驗(yàn)組引物,衛(wèi)氏貍殖吸蟲的18SrDNA基因引物作為內(nèi)參引物做實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime PCR)。根據(jù)所獲得的結(jié)果判斷斯氏貍殖吸蟲5個(gè)蟲期線粒體 cytb基因的表達(dá)情況并分析與不同蟲期蟲體致病情況的關(guān)系。<

3、br>　　結(jié)果:(1)獲得542bp的斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因片段,并將該基因片段納入NCBI基因庫中。根據(jù)該基因片段設(shè)計(jì)出一對(duì)斯氏貍殖吸蟲線粒體cytb基因片段的特異引物 CytbF:5′GGTTGCTTGATCATAACATTGG3′CytbR:5′GACACTCTGGGTCGACCTTG5′(2)通過在Genebank數(shù)據(jù)庫中Blast發(fā)現(xiàn),斯氏貍殖吸蟲的此段cytb序列與日本血吸蟲(中國流行區(qū)蟲種)、異盤并殖吸蟲、哈氏并殖

4、吸蟲、衛(wèi)氏并殖吸蟲以及斜睪吸蟲等有相似性,一共搜索到種7具有同源性的蟲種,對(duì)7種吸蟲線粒體cytb序列利用MEGA4計(jì)算遺傳距離,采用最大簡約法(MP)和鄰位相連法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, Bootstrap法檢驗(yàn),并Clusterx軟件對(duì)7種吸蟲線粒體cytb序列進(jìn)行多序列對(duì)比,用DNAsis軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得日本血吸蟲和斯氏貍殖吸蟲 cytb片段序列進(jìn)行序列分析,結(jié)果顯示,用NJ和MP方法構(gòu)建的遺傳系統(tǒng)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相似,同時(shí)用MEGA