斯氏線蟲抗逆性幼蟲cDNA文庫和差減文庫的建立與基因表達分析.pdf

1、昆蟲病原線蟲是一類新型的生物殺蟲劑，在害蟲治理中具有廣闊的應(yīng)用前景。抗逆性幼蟲是昆蟲病原線蟲發(fā)育過程中的一個特殊階段，它是唯一能在自然環(huán)境中存活的蟲態(tài)，其口、食道和肛門封閉，發(fā)育停止，具有較強的抵抗外界不良環(huán)境的能力。了解抗逆性幼蟲的基因表達對探討抗逆性機制以及抗逆性代謝機理具有十分重要的意義，進而為昆蟲病原線蟲的生產(chǎn)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。 本文構(gòu)建了蕪菁夜蛾斯氏線蟲Steinernema feltiae G26品系抗逆性幼蟲的c

2、DNA文庫，對部分片段進行了測序和同源性分析，并用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建了其抗逆性幼蟲和三齡發(fā)育幼蟲的差減cDNA文庫。 1.蕪菁夜蛾線蟲抗逆性幼蟲cDNA文庫構(gòu)建與基因表達分析通過提取S.feltiae G26品系抗逆性幼蟲的總RNA，采用LD-PCR(Long-Distance PCR)法合成了雙鏈cDNA，成功構(gòu)建了cDNA文庫，得到原始文庫的庫容為3.7×108cuf/ml。隨機挑取118個克隆，測序獲得100條序列，這些

3、序列按照蛋白質(zhì)功能分為熱激蛋白(heat shock protein)，核糖體大小亞基蛋白(ribosomal protein)、延伸因子(translation elongation factor 1-alpha)等。 2.蕪菁夜蛾線蟲正常發(fā)育三齡幼蟲和抗逆性幼蟲差減文庫構(gòu)建分別以抗逆性線蟲cDNA為tester，以發(fā)育三齡幼蟲的cDNA為driver，采用抑制性減法雜交構(gòu)建了差減文庫，共獲得1628個克隆。通過反向North

4、ern雜交，將其中38個陽性克隆送出測序，最終得到20條序列。利用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫中對獲得的cDNA序列進行相似性比對分析，除去重復序列后，共得到10個上升表達差異基因。這些基因所編碼的蛋白質(zhì)中有3個功能已知序列，其中一個為半胱氨酸蛋白酶抑制劑，推測與線蟲的抗逆性代謝機理有關(guān)；有7個基因在數(shù)據(jù)庫中找到同源性序列，但功能尚不清楚。 本研究結(jié)果可為闡明抗逆性幼蟲形成與發(fā)育機制以及抗逆代謝機理等提供重要理論依據(jù)，進而為