斯氏線蟲抗逆性幼蟲cDNA文庫(kù)和差減文庫(kù)的建立與基因表達(dá)分析.pdf

1、昆蟲病原線蟲是一類新型的生物殺蟲劑，在害蟲治理中具有廣闊的應(yīng)用前景?？鼓嫘杂紫x是昆蟲病原線蟲發(fā)育過程中的一個(gè)特殊階段，它是唯一能在自然環(huán)境中存活的蟲態(tài)，其口、食道和肛門封閉，發(fā)育停止，具有較強(qiáng)的抵抗外界不良環(huán)境的能力。了解抗逆性幼蟲的基因表達(dá)對(duì)探討抗逆性機(jī)制以及抗逆性代謝機(jī)理具有十分重要的意義，進(jìn)而為昆蟲病原線蟲的生產(chǎn)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。 本文構(gòu)建了蕪菁夜蛾斯氏線蟲Steinernema feltiae G26品系抗逆性幼蟲的c

2、DNA文庫(kù)，對(duì)部分片段進(jìn)行了測(cè)序和同源性分析，并用抑制差減雜交技術(shù)構(gòu)建了其抗逆性幼蟲和三齡發(fā)育幼蟲的差減cDNA文庫(kù)。 1.蕪菁夜蛾線蟲抗逆性幼蟲cDNA文庫(kù)構(gòu)建與基因表達(dá)分析通過提取S.feltiae G26品系抗逆性幼蟲的總RNA，采用LD-PCR(Long-Distance PCR)法合成了雙鏈cDNA，成功構(gòu)建了cDNA文庫(kù)，得到原始文庫(kù)的庫(kù)容為3.7×108cuf/ml。隨機(jī)挑取118個(gè)克隆，測(cè)序獲得100條序列，這些

3、序列按照蛋白質(zhì)功能分為熱激蛋白(heat shock protein)，核糖體大小亞基蛋白(ribosomal protein)、延伸因子(translation elongation factor 1-alpha)等。 2.蕪菁夜蛾線蟲正常發(fā)育三齡幼蟲和抗逆性幼蟲差減文庫(kù)構(gòu)建分別以抗逆性線蟲cDNA為tester，以發(fā)育三齡幼蟲的cDNA為driver，采用抑制性減法雜交構(gòu)建了差減文庫(kù)，共獲得1628個(gè)克隆。通過反向North

4、ern雜交，將其中38個(gè)陽性克隆送出測(cè)序，最終得到20條序列。利用BLAST在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)獲得的cDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析，除去重復(fù)序列后，共得到10個(gè)上升表達(dá)差異基因。這些基因所編碼的蛋白質(zhì)中有3個(gè)功能已知序列，其中一個(gè)為半胱氨酸蛋白酶抑制劑，推測(cè)與線蟲的抗逆性代謝機(jī)理有關(guān)；有7個(gè)基因在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到同源性序列，但功能尚不清楚。 本研究結(jié)果可為闡明抗逆性幼蟲形成與發(fā)育機(jī)制以及抗逆代謝機(jī)理等提供重要理論依據(jù)，進(jìn)而為