瑟氏泰勒蟲p33基因在酵母菌中的表達(dá).pdf

1、瑟氏泰勒蟲（Theileria sergenti）是寄生于牛體內(nèi)的一種血液原蟲，是泰勒蟲科、泰勒蟲屬，主要寄生于牛的淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中，通過蜱進(jìn)行傳播。現(xiàn)階段，隨著養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展，牛的瑟氏泰勒蟲病近幾年發(fā)生頻率呈現(xiàn)上升趨勢，對養(yǎng)牛業(yè)的危害極大。但到目前為止還沒有特效藥物用于瑟氏泰勒蟲病的治療和預(yù)防，而且尚無該病的疫苗。瑟氏泰勒蟲p33基因，是該蟲體的主要表面蛋白基因，具有較好的免疫原性和反應(yīng)原性，認(rèn)為是較理想的候選抗原。

2、r>　　真核表達(dá)系統(tǒng)，除了具備原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點外，還具有表達(dá)外源蛋白量高、遺傳性狀穩(wěn)定、產(chǎn)物提純簡單等諸多優(yōu)點，受到越來越多的人青睞。本試驗根據(jù)Genbank中T.sergenti p33基因中國株序列，設(shè)計一對特異性引物，用常規(guī)PCR擴增出大小為786 bp的p33目的基因片段，將其克隆到pMD-19-T載體上，構(gòu)建pMD-19-T-p33重組克隆質(zhì)粒，經(jīng)PCR、雙酶切鑒定測序分析，證實目的片段正確地克隆到pMD-19-T載體上。然

3、后將p33基因亞克隆到酵母表達(dá)載體pPICZα A上，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、EcoRⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定，證實成功構(gòu)建含有目的基因片段的真核表達(dá)載體pPICZα A-p33。然后將其轉(zhuǎn)化到GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞中，最終通過800μg/ml濃度的博來霉素篩選得到高拷貝重組子，經(jīng)PCR篩選陽性菌株后，通過最終濃度為1％的甲醇誘導(dǎo)并在畢赤酵母中大量表達(dá)外源蛋白，然后對誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE，得到大小為29.67 Ku的蛋白，與預(yù)期結(jié)果相