弓形蟲(chóng)速殖子與緩殖子體外轉(zhuǎn)化體系的建立及BAG1基因在轉(zhuǎn)化中作用的初步研究.pdf

1、剛地弓形蟲(chóng)(Toxplasma gondii)是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲(chóng),能感染所有的恒溫動(dòng)物,引起人獸共患的弓形蟲(chóng)病。此蟲(chóng)呈世界性分布,估計(jì)人類感染弓形蟲(chóng)的血清學(xué)陽(yáng)性率達(dá)到30％。弓形蟲(chóng)是一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng),在宿主免疫力正常的情況下,大多表現(xiàn)為無(wú)臨床癥狀的隱性感染,短則數(shù)月,長(zhǎng)則數(shù)年甚至終生寄生在人體。而當(dāng)機(jī)體免疫功能下降或受抑制(如惡性腫瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)時(shí),處于隱性感染狀態(tài)的蟲(chóng)體就會(huì)活化,迅速增生繁殖,破壞宿主細(xì)胞

2、,引起多器官的損害,嚴(yán)重者可導(dǎo)致宿主死亡。孕婦感染弓形蟲(chóng)后,除自身患病外,還可通過(guò)胎盤(pán)將蟲(chóng)體垂直傳播給胎兒,從而引起流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、畸形等,幸存者也常遺留智能低下等嚴(yán)重后遺癥。近年來(lái),由于艾滋病的流行和寵物飼養(yǎng)的逐漸增多,弓形蟲(chóng)的危害也日益突出,弓形蟲(chóng)病的防治已成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。
　　 弓形蟲(chóng)感染的特點(diǎn)是機(jī)會(huì)性致病,其生物學(xué)基礎(chǔ)是速殖子和緩殖子的相互轉(zhuǎn)換。目前對(duì)弓形蟲(chóng)病的治療仍以藥物為主,如乙胺嘧啶、乙酰螺旋霉素、復(fù)

3、方新諾明等及一些細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2等的單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用,對(duì)速殖子的殺滅、抑制作用較明顯,但對(duì)包囊內(nèi)的緩殖子則幾乎沒(méi)有作用。作為弓形蟲(chóng)治療藥物和疫苗研制的重要靶標(biāo),弓形蟲(chóng)速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化的機(jī)制一直是弓形蟲(chóng)研究的熱點(diǎn),建立弓形蟲(chóng)速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化的體外模型對(duì)于這一機(jī)制的研究具有重要意義。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期摸索,科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)狀況下,通過(guò)改變理化(如培養(yǎng)基的溫度、pH值或剝奪營(yíng)養(yǎng))和生物(如加入IFN-γ或NO)條件,可以實(shí)

4、現(xiàn)速殖子與緩殖子的轉(zhuǎn)化,然而,改變外界條件引起的轉(zhuǎn)化過(guò)程與自然條件下的轉(zhuǎn)化過(guò)程還是存在一定的差距。本實(shí)驗(yàn)嘗試在盡可能自然的條件下,在COS-7細(xì)胞內(nèi)建立弓形蟲(chóng)速殖子和緩殖子相互轉(zhuǎn)化的體外模型。
　　 弓形蟲(chóng)緩殖子期抗原1(bradyzoite antigen 1,BAG1),是弓形蟲(chóng)緩殖子主要期特異性抗原之一,BAG1在弓形蟲(chóng)速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)變的早期被表達(dá),是成熟組織包囊的主要蛋白,但BAG1對(duì)此轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響尚不清楚。近年來(lái),

5、以RNA干擾和轉(zhuǎn)基因技術(shù)為基礎(chǔ)的反向遺傳學(xué)的發(fā)展,為我們提供了一個(gè)從基因變化分析基因功能的方法。本研究將構(gòu)建好的以弓形蟲(chóng)速殖子期特異抗原SAG1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP蛋白基因?yàn)楹Y選標(biāo)志的且靶向BAG1基因的可遺傳可誘導(dǎo)的RNAi載體pHANA-hairpin/BAG1導(dǎo)入弓形蟲(chóng)速殖子并篩選出純的轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)品系。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的RNAi載體內(nèi)含有BAG1編碼基因的顛倒重復(fù)序列,在其轉(zhuǎn)錄過(guò)程中通過(guò)分子內(nèi)雜交,該顛倒重復(fù)序列將會(huì)折疊形成Hair

6、pin dsRNA。hpRNA最終被Dicer加工成siRNA,通過(guò)靶向結(jié)合內(nèi)源性的BAG1 mRNA,從而干擾BAG1基因的功能。本實(shí)驗(yàn)RNAi載體中的GFP編碼序列在SAG1啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下進(jìn)行表達(dá),主要在速殖了期起作用,在緩殖了期GFP表達(dá)減弱或消失。因此,通過(guò)綠色熒光的表達(dá)強(qiáng)弱可以判斷弓形蟲(chóng)的轉(zhuǎn)化狀態(tài),并進(jìn)一步推斷BAG1基因?qū)D(zhuǎn)化過(guò)程的影響,以闡明其在速殖了向緩殖子轉(zhuǎn)化過(guò)程中的功能和作用。
　　 目的:
　　 1

7、.建立弓形蟲(chóng)速殖予與緩殖子體外轉(zhuǎn)化體系；
　　 2.建立轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)品系；
　　 3.探討弓形蟲(chóng)緩殖子期特異蛋白BAG1基因的功能及在速殖子與緩殖子相互轉(zhuǎn)化中的作用。
　　 方法:
　　 1.復(fù)蘇液氮凍存的弓形蟲(chóng)RH株速殖子,接種小鼠腹腔,連續(xù)傳代轉(zhuǎn)種3次后,用生理鹽水沖洗小鼠腹腔,純化收集速殖子。
　　 2.當(dāng)COS-7細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)瓶的60％～70％時(shí),按照1:10比例接種弓形蟲(chóng)速殖子,置于

8、37℃,5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　 3.分別在接種后第1、2、3、4、5、6天觀察細(xì)胞和蟲(chóng)體的形態(tài)并提取每瓶細(xì)胞和蟲(chóng)體的Total RNA,用RT-PCR的方法檢測(cè)速殖子期特異性蛋白SAG1基因、緩殖子期特異性蛋白BAG1基因和SAG2C基因的表達(dá)。
　　 4.將構(gòu)建好的以弓形蟲(chóng)速殖子期特異抗原SAG1基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP蛋白基因?yàn)楹Y選標(biāo)志的且靶向BAG1基因的RNAi載體pHANA-hairpin/BAG1用電

9、穿孔的方法導(dǎo)入弓形蟲(chóng)RH株速殖子內(nèi),擴(kuò)大培養(yǎng)后,用有限稀釋法篩選出純的轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)。
　　 5.將純化的轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)RH株速殖子按已建立好的條件接種于COS-7細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)。分別在接種后第1、2、3、4、5、6天觀察速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)變的過(guò)程并提取每瓶細(xì)胞和蟲(chóng)體的Total RNA,用RT-PCR的方法檢測(cè)速殖子期特異性蛋白SAG1基因、緩殖子期特異性蛋白BAG1基因和SAG2C基因的表達(dá)。
　　 6.將純化的轉(zhuǎn)基因

10、弓形蟲(chóng)RH株速殖子及普通弓形蟲(chóng)速殖子按已建好的條件接種于COS-7細(xì)胞內(nèi)。在熒光倒置顯微鏡下分別計(jì)算轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)及普通弓形蟲(chóng)在1-6天內(nèi)形成類包囊樣結(jié)構(gòu)的數(shù)量,收集數(shù)據(jù),進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.隨著速殖子在COS-7細(xì)胞中培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù),蟲(chóng)體的數(shù)量逐漸增多,但增殖速度逐步減緩；蟲(chóng)體在細(xì)胞內(nèi)的排列方式也在不斷變化,由成對(duì)的弧形、玫瑰花形或簇形、變成半圓形最后形成圓形的類包囊樣結(jié)構(gòu)。RT-PCR檢測(cè)顯示:速殖

11、子期特異性蛋白SAG1基因在培養(yǎng)的第1-6天均有表達(dá),且表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)；緩殖子期特異性蛋白BAG1基因從第2天開(kāi)始出現(xiàn)表達(dá),隨時(shí)間延續(xù)表達(dá)量逐漸增加；緩殖子期特異性蛋白SAG2C基因從第5天開(kāi)始表達(dá),第6天表達(dá)量增加。以上結(jié)果表明有越來(lái)越多的速殖子轉(zhuǎn)化為緩殖子。
　　 2.將RNAi載體用電穿孔的方法導(dǎo)入弓形蟲(chóng)RH株速殖子內(nèi),電轉(zhuǎn)24h后即可觀察到發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)。用有限稀釋法篩選出純的轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)。
　　 3

12、.利用已建立的弓形蟲(chóng)體外轉(zhuǎn)化模型促使速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)化,隨著純化的轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)速殖子在COS-7細(xì)胞中培養(yǎng)時(shí)間的延續(xù),蟲(chóng)體的數(shù)量逐漸增多,但增殖速度逐步減緩；蟲(chóng)體在細(xì)胞內(nèi)的排列方式也在不斷變化,由成對(duì)的弧形、玫瑰花形或簇形、變成半圓形最后形成圓形的類包囊樣結(jié)構(gòu)。隨著時(shí)間的延續(xù),綠色熒光強(qiáng)度略有降低。RT-PCR檢測(cè)顯示:速殖子期特異性蛋白SAG1基因在培養(yǎng)的第1-6天均有表達(dá),且表達(dá)量呈遞增趨勢(shì)；緩殖子期特異性蛋白BAG1基因從第5天開(kāi)

13、始出現(xiàn)表達(dá),隨時(shí)間延續(xù)表達(dá)量逐漸增加:緩殖子期特異性蛋白SAG2C基因從第5天開(kāi)始表達(dá),第6天表達(dá)量增加。
　　 4.轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)形成的類包囊數(shù)與普通弓形蟲(chóng)形成的類包囊數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=53.263,P<0.001)。數(shù)據(jù)顯示:轉(zhuǎn)基因弓形蟲(chóng)出現(xiàn)類包囊樣結(jié)構(gòu)的時(shí)間比普通弓形蟲(chóng)晚,且數(shù)量也少。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建弓形蟲(chóng)速殖子與緩殖子體外相互轉(zhuǎn)化體系,為其轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 2.成