大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向甲狀旁腺細(xì)胞定向分化的體外研究.pdf

1、目的：
　　通過用甲狀旁腺細(xì)胞培養(yǎng)液體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），促使BMSCs向甲狀旁腺細(xì)胞定向分化。為BMSCs應(yīng)用于臨床治療甲狀旁腺功能減退癥奠定理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　?。?）SD大鼠甲狀旁腺細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
　　選取體重約150g±20g健康雄性SD大鼠，取其甲狀旁腺，漂洗、剪碎、消化后，接種于培養(yǎng)瓶中，用RPMI1640培養(yǎng)液中（含15％FBS）培養(yǎng)。
　?。?）SD大鼠甲

2、狀旁腺細(xì)胞培養(yǎng)液的制備
　　選取第3代、融合率達(dá)80%的SD大鼠甲狀旁腺細(xì)胞，洗滌后換DMEM-F12培養(yǎng)液(含15%FBS),每天收集細(xì)胞培養(yǎng)液。將培養(yǎng)液離心后取上清經(jīng)0.22um的微孔濾膜過濾，凍存?zhèn)溆谩Ｊ褂们鞍?:2(v/v)比例與DMEM-F12培養(yǎng)液(含15%FBS)混合。
　?。?）SD大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　選取1周齡的健康雄性SD大鼠，無菌下取股骨及脛骨。采用全骨髓貼壁培養(yǎng)篩選法獲取SD大

3、鼠BMSCs。取第3代SD大鼠BMSCs，加入CD45、CD90、CD29、CD11b補(bǔ)體抗體，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，對SD大鼠BMSCs進(jìn)行鑒定。
　?。?）SD大鼠BMSCs的分化、鑒定
　　用甲狀旁腺細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，設(shè)實(shí)驗(yàn)組及陽性對照組。分別于7d、14d、21d和28d后收集細(xì)胞，通過WesternBlot、RT-PCR方法檢測甲狀旁腺細(xì)胞表面標(biāo)志物（PTH、CASR、GCM2）的表達(dá)。
　　結(jié)

4、果：
　　(1)鏡下觀察到形態(tài)均一的SD大鼠甲狀旁腺細(xì)胞。
　　(2)能夠穩(wěn)定傳代且均一性良好的SD大鼠BMSCs。流式細(xì)胞儀檢測第3代SD大鼠BMSCs的純度高達(dá)95%以上。
　　(3)SD大鼠甲狀旁腺細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)的SD大鼠BMSCs，分化為類甲狀旁腺細(xì)胞，WB及RT-PCR可以檢測到甲狀旁腺細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，且其表達(dá)的量隨著培養(yǎng)液培養(yǎng)時(shí)間的延長而增高。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功證實(shí)，用SD大鼠甲狀旁腺細(xì)胞培