表達(dá)新城疫病毒ZJ1株F基因的重組馬立克氏病毒的構(gòu)建.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)和馬立克氏病(Marek's disease，MD)是兩種危害養(yǎng)禽業(yè)的重要病毒性傳染病。本研究利用馬立克氏病毒(MDV)RispensCVI988疫苗毒株為載體，表達(dá)新城疫病毒(NDV)基因VII型流行毒株ZJ1的融合蛋白(F)，構(gòu)建針對ND和MD的多價重組疫苗。 以MDV Rispens CVI988毒株基因組短獨(dú)特區(qū)的sorf1和sorf2基因作為插入位點(diǎn)，選擇網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥

2、病毒(REV)基因組的長末端重復(fù)序列(LTR)作為啟動子，構(gòu)建含NDV ZJ1毒株F基因及報告基因(smGFP)的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pMDV/F/GFP。將MDV感染細(xì)胞的DNA和轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA共轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，經(jīng)同源重組獲得重組病毒。再通過篩選和純化，得到重組病毒rMDV-F/GFP。然后，用Cre重組酶去除重組病毒基因組中的報告基因，得到僅帶LTR啟動子和F基因的重組MDV疫苗毒株rMDV-F。經(jīng)PCR、間接免疫熒光(I

3、FA)試驗證明，F(xiàn)基因已正確插入到MDV基因組中并得以表達(dá)。在CEF上連續(xù)培養(yǎng)7代后獲得的rMDV-F，經(jīng)PCR和IFA試驗證實(shí)，仍具有良好的遺傳穩(wěn)定性。 我們還評價了重組病毒rMDV-F對ND和MD的實(shí)驗室免疫保護(hù)效力。在第1批試驗中，以3000PFU的rMDV-F免疫一組1日齡SPF雞，以0.2ml/雞的滅活苗免疫另一組7日齡SPF雞，另設(shè)攻毒對照組和空白對照組；在21日齡用10LD50的NDV F48E8強(qiáng)毒株進(jìn)行攻擊，r

4、MDV-F免疫組保護(hù)率為83.33％，滅活苗免疫組保護(hù)率為100％，攻毒對照組的雞全部發(fā)病死亡，空白對照組的雞全部存活。在第2批試驗中，以3000PFU的rMDV-F免疫一組1日齡SPF雞，以同樣劑量的MDVRispens CVI988毒株免疫另一組1日齡SPF雞，另設(shè)攻毒對照組和空白對照組；在7日齡以500PFU的MDV RBIB超強(qiáng)毒株攻擊，觀察至90日齡，對所有試驗雞進(jìn)行剖檢和組織學(xué)檢查：rMDV-F免疫組與MDV Rispens