硒和Vc對(duì)Triol導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)理.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是嚴(yán)重威脅人類的疾病之一，氧化型固醇被認(rèn)為是AS的主要致病因素。揭示氧化型固醇的細(xì)胞毒性及其在AS發(fā)病機(jī)制中的作用、研究AS發(fā)生和發(fā)展的防治，仍然是當(dāng)前人口與健康研究領(lǐng)域的前沿課題之一。維生素C和必需微量元素硒（Se）在防治AS發(fā)生和發(fā)展方面的功能受到人們的高度重視，但其作用機(jī)理仍不十分清楚。本文以大鼠血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）為對(duì)象，研究了維生素C（Vc）對(duì)VSMC生長(zhǎng)的影響，探討了氧化型固醇Triol（chole

2、stane-3b-5a-6b-triol）對(duì)細(xì)胞的損傷作用及補(bǔ)充微量元素硒和維生素C對(duì)其損傷的抑制機(jī)理，取得如下主要結(jié)果：1）應(yīng)用MTT檢測(cè)、熒光顯微鏡觀察及DNA凝膠電泳，研究了維生素C對(duì)VSMC生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，低劑量的維生素C促進(jìn)細(xì)胞的增殖，而高劑量的維生素C降低細(xì)胞的存活率，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究表明，高劑量的維生素C（≥500mM）具有促氧化作用，改變細(xì)胞內(nèi)的還原狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，引起抗氧化酶GPx及SOD的活

3、性下降。高劑量的維生素C還刺激胞內(nèi)ROS產(chǎn)生以及Ca2+濃度增加，抑制bcl-2的mRNA表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。2）通過繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、MTT檢測(cè)、GPx、SOD酶活性測(cè)試、脂質(zhì)過氧化水平測(cè)定及GPx和TRmRNA表達(dá)水平檢測(cè)研究了Triol對(duì)大鼠VSMC的毒性作用及Na2SeO3和Vc對(duì)Triol細(xì)胞毒性的保護(hù)作用。結(jié)果表明，Triol抑制VSMC生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，引起細(xì)胞GPx和SOD酶活性下降，細(xì)胞脂質(zhì)過氧化物水平增加，

4、總抗氧化能力減弱，顯著降低細(xì)胞存活率，且這些作用呈濃度和時(shí)間的依賴關(guān)系。Na2SeO3和Vc預(yù)孵育細(xì)胞都能有效幫助VSMC細(xì)胞抵抗Triol的毒性。Na2SeO3通過提高增加細(xì)胞GPx和TR的mRNA表達(dá)水平，增加細(xì)胞GPx、SOD酶活性，降低細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷，提高細(xì)胞存活率。Na2SeO3對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用隨預(yù)孵育的時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。Vc作為抗氧化劑，可以清除Triol誘導(dǎo)產(chǎn)生脂質(zhì)氫過氧化物，從而減少Triol引起的細(xì)胞氧化損傷，維持

5、細(xì)胞內(nèi)GPx、SOD酶活性，降低脂質(zhì)過氧化損傷。Vc對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用有明顯的量效關(guān)系，Na2SeO3和Vc同時(shí)預(yù)孵育細(xì)胞，二者出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)。3）通過檢測(cè)LDH漏出率、DPH熒光探針測(cè)定細(xì)胞膜流動(dòng)性的，AFM直接觀察VSMC細(xì)胞膜表面，并利用顯微傅里葉變換紅外光譜技術(shù)進(jìn)行膜蛋白構(gòu)象分析，研究了Triol對(duì)細(xì)胞膜的損傷以及硒和維生素C的作用。結(jié)果表明，Triol作用細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生極強(qiáng)的損傷。Triol不僅可以插入到細(xì)胞膜中，還可以破壞細(xì)

6、胞膜表面蛋白及跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞膜的流動(dòng)性明顯降低；導(dǎo)致細(xì)胞膜表面粗糙度顯著增加，細(xì)胞膜孔徑明顯增大；細(xì)胞膜的通透性增加，胞內(nèi)LDH大量漏出。Na2SeO3和Vc能減弱Triol對(duì)細(xì)胞膜的損傷。4）應(yīng)用熒光顯微鏡觀察、DNA凝膠電泳及流式細(xì)胞術(shù)，研究Triol對(duì)VSMC凋亡的影響。結(jié)果表明，細(xì)胞的凋亡率隨Triol濃度的增加而加大，而硒和維生素C可在一定程度上抑制Triol誘導(dǎo)的VSMC凋亡。我們進(jìn)一步分別采用DCFH-DA、Fur

7、a-2/AM及Rh-123作為熒光探針檢測(cè)Triol對(duì)VSMC胞內(nèi)活性氧、游離鈣離子濃度和線粒體跨膜電位的影響，發(fā)現(xiàn)Triol可以增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，引起胞外鈣內(nèi)流和胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放，誘發(fā)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，降低線粒體的跨膜電位。應(yīng)用RT-PCR的方法研究了Triol處理的細(xì)胞中c-myc和bcl-2的mRNA的表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)Triol可以降低c-myc和bcl-2的mRNA的表達(dá)水平。這些結(jié)果說明Triol誘導(dǎo)大鼠VSMC凋

8、亡與線粒體凋亡途徑密切相關(guān)，且與Triol下調(diào)c-myc和bcl-2基因的mRNA水平有關(guān)。Na2SeO3和維生素C預(yù)孵育細(xì)胞可在一定程度上抑制Triol誘導(dǎo)的VSMC凋亡。Na2SeO3通過減少Triol誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，并通過穩(wěn)定細(xì)胞膜及線粒體膜，維持胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)，保持c-myc和bcl-2基因的表達(dá)來減輕細(xì)胞受到的損傷，抑制Triol誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。維生素C增強(qiáng)胞內(nèi)的抗氧化能力，減少Triol導(dǎo)致的胞內(nèi)ROS蓄積和游離鈣離子的