斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性基因和lncRNA的篩選與調(diào)控機(jī)制分析.pdf

1、腹瀉是導(dǎo)致斷奶仔豬死亡的重要傳染性疾病，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，F(xiàn)18大腸桿菌(E.coli F18)菌株是引起斷奶仔豬細(xì)菌性腹瀉的主要病原菌之一。為了進(jìn)一步揭示中國地方豬品種斷奶仔豬抗E.coli F18的遺傳基礎(chǔ)和調(diào)控機(jī)制，本研究以地方品種一梅山豬為研究對象，利用不同血清型F18大腸桿菌F18ab和F18ac菌株口服攻毒試驗(yàn)，并結(jié)合仔豬腸道E.coli F18細(xì)菌檢測、細(xì)菌計(jì)數(shù)以及小腸上皮細(xì)胞黏附等一系列試驗(yàn)驗(yàn)證，篩選出確證的

2、梅山豬F18大腸桿菌抗性與敏感型斷奶仔豬個(gè)體，進(jìn)一步利用RNA-seq轉(zhuǎn)錄組和長鏈非編碼RNA(lncRNA)測序?qū)γ飞截iF18大腸桿菌抗性相關(guān)調(diào)控通路、功能基因以及l(fā)ncRNA進(jìn)行了系統(tǒng)篩選，并從mRNA、蛋白質(zhì)以及細(xì)胞水平分別對重要調(diào)控通路、關(guān)鍵基因以及l(fā)ncRNA進(jìn)行系統(tǒng)的功能驗(yàn)證，以期揭示功能基因及l(fā)ncRNA在梅山斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性過程中的調(diào)控作用及其分子機(jī)制，為解決國內(nèi)地方豬種E.coli F18抗性育種關(guān)鍵科學(xué)問題

3、提供一定的理論參考。此外，本研究同時(shí)以培育品種—蘇太豬（杜洛克×梅山豬）為研究對象，基于課題組前期建立的蘇太豬F18大腸桿菌抗性與敏感型資源群體，利用高通量測序分析了蘇太豬F18大腸桿菌抗性相關(guān)的調(diào)控通路以及候選基因，結(jié)合關(guān)于外來豬品種F18大腸桿菌抗性基因的文獻(xiàn)挖掘結(jié)果，進(jìn)一步探討和驗(yàn)證外來豬品種F18大腸桿菌抗性相關(guān)的調(diào)控通路以及候選基因，以期揭示中外豬品種F18大腸桿菌抗性調(diào)控遺傳基礎(chǔ)的差異性。
　　主要研究結(jié)果如下:

4、>　　1.梅山斷奶仔豬E.coli F18敏感和抗性型個(gè)體間十二指腸轉(zhuǎn)錄組分析
　　(1)梅山斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性與敏感型個(gè)體間篩選出198個(gè)差異表達(dá)基因DGEs，其中抗性組上調(diào)基因125個(gè)，大部分DGEs涉及到免疫系統(tǒng)“Immune System”和感染性疾病“Infectious Diseases”通路，其中篩選出一個(gè)富集程度較高的免疫通路—Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling

5、 pathway)以及通路中關(guān)鍵的基因CD14。
　　(2)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后，qPCR和western blot檢測發(fā)現(xiàn)Toll樣受體信號通路中大部分基因（CD14、TLR4、IL-1β、ERK、IFN-α、JNK、p38、NFkB和TNF-α）表達(dá)水平均表現(xiàn)出明顯的上調(diào)，表明Toll樣受體信號通路在調(diào)控F18大腸桿菌感染過程中確實(shí)發(fā)揮重要的作用。
　　(3)免疫組化IHC結(jié)果表明，CD14在

6、腸道組織中廣泛分布，并且抗性組中表達(dá)水平明顯高于敏感組;利用RNAi沉默CD14基因后，F(xiàn)18ab菌毛與IPEC-J2黏附能力極顯著上升(P＜0.01)，而F18ac菌毛與IPEC-J2黏附能力上升但不顯著（P＞0.05）;通路中IL-1、IFN-α、TLR4和TNF-α基因表達(dá)水平均發(fā)生顯著下調(diào)(P＜0.05)，而MyD88基因表達(dá)水平下調(diào)但不顯著（P＞0.05）;白細(xì)胞介素（IL-6和IL-12）因子表達(dá)水平顯著下降(P＜0.05)

7、，而IL-8、MIP-1α和MIP-1β表達(dá)量降低但未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。以上結(jié)果表明CD14表達(dá)水平上調(diào)有利于提高F18大腸桿菌抗性。
　　2.蘇太斷奶仔豬E.coli F18敏感和抗性型個(gè)體間十二指腸轉(zhuǎn)錄組分析
　　(1)蘇太斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性與敏感型個(gè)體間篩選出238個(gè)差異表達(dá)基因DGEs，其中抗性組上調(diào)基因112個(gè)，DGEs涉及到免疫相關(guān)通路如抗原加工與呈遞(Antigenprocessing an

8、d presentation)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)，其中包括TAP2、TLR5、IL1β基因;以及鞘糖脂合成通路(Glycosphingolipid biosynthesis-lactoand neolacto series)，其中包括具有重要生物學(xué)功能的FUT2基因。
　　(2) LPS誘導(dǎo)以及不同血清型F18大腸桿菌F18ac、F18ab分別刺激小

9、腸上皮細(xì)胞IPEC-J2后，qPCR和Western blot檢測FUT2、TAP2、IL-1β和TLR5表達(dá)水平均表現(xiàn)為明顯的上調(diào);組織表達(dá)譜檢測表明，F(xiàn)UT2基因在肝臟、脾臟、肺、腎臟、胃、淋巴結(jié)、胸腺、十二指腸和空腸等組織中均有表達(dá)，其中腸道組織尤其是十二指腸表達(dá)量相對較高，qPCR和western blot檢測表明，敏感組個(gè)體十二指腸和空腸組織中FUT2基因表達(dá)水平均極顯著高于抗性組(P＜0.01);利用RNAi沉默F(xiàn)UT2基因

10、后，IPEC-J2細(xì)胞對大腸桿菌F18ab和F18ac的黏附能力均顯著下降（P＜0.05），以上結(jié)果表明FUT2基因表達(dá)水平下調(diào)有利于提高F18大腸桿菌抗性。
　　(3) FUT2啟動(dòng)子區(qū)甲基化分析表明，22個(gè)CpG位點(diǎn)存在不同程度的甲基化，mC-6和mC-22位點(diǎn)甲基化水平與mRNA表達(dá)存在顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，其中mC-22位于Sp1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上;凝膠遷移EMSA試驗(yàn)表明，十二指腸組織中核蛋白與FUT2野生型非甲基

11、化探針結(jié)合，加入Sp1抗體后，非甲基化野生型探針出現(xiàn)了超遷移(supershift)現(xiàn)象，表明核蛋白中Sp1轉(zhuǎn)錄因子可以特異性結(jié)合FUT2野生型非甲基化探針，以上結(jié)果表明，F(xiàn)UT2啟動(dòng)子區(qū)mC-22位點(diǎn)甲基化修飾抑制了Sp1轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子DNA結(jié)合，降低了FUT2基因表達(dá)水平，進(jìn)而提升了F18大腸桿菌抗性。
　　3.梅山與蘇太斷奶仔豬E.coli F18敏感和抗性型個(gè)體間十二指腸長鏈非編碼RNA分析
　　(1)lncRNA

12、測序結(jié)合生物信息學(xué)分析在梅山豬和蘇太豬中共獲得2056個(gè)候選lncRNA分子，根據(jù)p-value＜0.05原則，梅山斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性型與敏感型個(gè)體之間存在24個(gè)差異表達(dá)lncRNA，其中抗性組中上調(diào)21個(gè);蘇太豬存在23個(gè)差異表達(dá)lncRNA，其中抗性組中上調(diào)7個(gè)。基于cis和trans機(jī)制進(jìn)行靶基因預(yù)測發(fā)現(xiàn)，cis機(jī)制預(yù)測出梅山豬所有差異表達(dá)lncRNA上下游共存在59個(gè)可能靶基因，而蘇太豬所有差異表達(dá)lncRNA上下游存在

13、67個(gè)可能靶基因;trans機(jī)制預(yù)測出梅山豬RNA-seq中存在517個(gè)基因與差異lncRNA存在顯著的表達(dá)相關(guān)性，而蘇太豬RNA-seq中存在96個(gè)基因與差異lncRNA存在顯著的表達(dá)相關(guān)性。靶基因參與GO功能以及KEGG通路分析表明，靶基因涉及到信號傳導(dǎo)通路(如NF-kappa B signaling pathway)、免疫相關(guān)通路(如Toll-like receptor signalingpathway)、疾病感染通路（如Salm

14、onella infection）、糖脂類合成相關(guān)通路（如Glycosaminoglycan biosynthesis-KS）等。
　　(2)梅山豬與蘇太豬抗性與敏感型個(gè)體十二指腸間存在3個(gè)共同差異表達(dá)lncRNA:TCONS_00183659、TCONS_00352975、TCONS_00053650;結(jié)合靶基因預(yù)測及其功能分析，篩選出一個(gè)與F18大腸桿菌抗性相關(guān)的重要lncRNA—TCONS_00183659，其序列100 k

15、b范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)可能靶基因FUT3。TCONS_00183659位于豬2號染色體，長度為5831 bp，具有兩個(gè)exon（5746 bp和85 bp），是不連續(xù)的，屬于基因間的lncRNA。
　　(3) qPCR檢測結(jié)果表明，TCONS_00183659在梅山豬和蘇太豬F18抗性組個(gè)體十二指腸組織中表達(dá)水平極顯著高于敏感組個(gè)體(P＜0.01);熒光原位雜交技術(shù)FISH分析表明，TCONS_00183659在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布

16、;成功建立沉默TCONS_00183659豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2系，干擾效率達(dá)到69.58％; RNApull down結(jié)合western blot驗(yàn)證表明，TCONS_00183659與Histone H4存在相互作用;TCONS_00183659干擾前后IPEC-J2蛋白組學(xué)結(jié)合western blot驗(yàn)證分析表明，干擾TCONS_00053650后Mx1、Mx2、IFIT2蛋白表達(dá)升高。以上結(jié)果表明，TCONS_001836

17、59可能通過與組蛋白Histone H4結(jié)合，從而調(diào)控Mx1、Mx2、IFIT2蛋白表達(dá)。
　　結(jié)合前期國內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果，本研究進(jìn)一步揭示了中外豬品種F18大腸桿菌抗性調(diào)控的遺傳基礎(chǔ)確實(shí)存在差異，Toll樣受體信號通路及其CD14基因在梅山豬抵抗F18大腸桿菌感染過程中發(fā)揮著免疫調(diào)控作用，其中CD14基因表達(dá)上調(diào)有利于提高仔豬對E.coliF18感染抗性;而鞘糖脂合成通路及其FUT2基因可能在外來豬品種F18大腸桿菌受體形成過程