應(yīng)用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)篩選仔豬大腸桿菌0139體內(nèi)表達(dá)基因的初步研究.pdf

1、豬致病性大腸桿菌病是對規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)危害較嚴(yán)重的傳染性疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。一方面，大腸桿菌的血清型復(fù)雜，致病性大腸桿菌血清型不斷發(fā)生變化，導(dǎo)致免疫失敗，給豬大腸桿菌病的控制增加了困難。另一方面，由于近年來抗生素的廣泛持續(xù)利不當(dāng)使用，導(dǎo)致大腸桿菌耐藥株的不斷增多，耐藥機(jī)制的不斷變遷，使人們對大腸桿菌病的治療變得十分困難。因此，本研究擬利用體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)，希望找到一些大腸桿菌的體內(nèi)誘導(dǎo)基因，并分析它們的功能，從而能進(jìn)一步了

2、解大腸桿菌病的具體致病機(jī)制，為將來發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標(biāo)，研發(fā)新的疫苗和診斷試劑提供一些新的線索。 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(in vivo—induced antigen technology，IVIAT)是快速鑒定體內(nèi)特異性表達(dá)抗原基因的高通量篩檢技術(shù)。其原理是利用體外培養(yǎng)的病原微生物去除感染動物血清中針對體外表達(dá)抗原的抗體，再用此吸附血清作為探針來篩選病原微生物基因組表達(dá)文庫中體內(nèi)特異性表達(dá)抗原的基因，旨在為新藥、新疫苗利新型診斷方法研

3、發(fā)提供新靶標(biāo)，為進(jìn)一步闡明病原體致病與免疫機(jī)理提供理論依據(jù)。 病原菌感染機(jī)體后體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)的抗原通常與病原菌的致病性機(jī)制密切相關(guān)。為了研究致病性大腸桿菌感染機(jī)體過程中存在的致病因子，本研究采用了體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)，以致病性大腸桿菌O139為研究對象，對其在體內(nèi)的表達(dá)基因進(jìn)行了篩選。 首先構(gòu)建了豬源大腸桿菌O139的基因組表達(dá)文庫：提取了豬源大腸桿菌O139的基因組，用限制性內(nèi)切酶Sau3AI不完全酶切并回收1～4Kb的基因

4、組DNA片段。限制性內(nèi)切酶BamHI酶切原核表達(dá)載體pET-32a(+)，回收線性載體，用CIAP去磷酸化。將上述兩種酶切回收DNA片段進(jìn)行連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，堿裂解法提取重組質(zhì)粒，用 XhoI和 NcoI雙酶切的方法對提取的重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果達(dá)到符合要求。把大量提取的重組質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)入新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞BL21中，計(jì)算表達(dá)文庫的庫容量，經(jīng)過計(jì)算文庫容量為1.2×104，滿足了我們研究工作的需要，之后隨機(jī)挑取10個(gè)克

5、隆用上述雙酶切方法鑒定文庫．結(jié)果顯示隨機(jī)挑選的10個(gè)克隆都為陽性克隆，酶切后載體片段約為5.9Kb，插入片段基本位于2～4Kb之間。說明大腸桿菌基因組O139的表達(dá)文庫構(gòu)建的比較成功，為進(jìn)一步篩選大腸桿曲體內(nèi)誘導(dǎo)基因奠定了良好的基礎(chǔ)。 然后對大腸桿菌基因組表達(dá)文庫進(jìn)行了篩選：收集感染致病性大腸桿菌仔豬的血清，用玻板凝集法檢測仔豬血清抗體，比較符合率，符合率為30％(3/10)，與菌株血清型鑒定一致。用經(jīng)體外培養(yǎng)的大腸桿菌菌株O1