TLR4基因?qū)嗄套胸iF18大腸桿菌抗性調(diào)節(jié)機(jī)制的初步分析.pdf

1、F18大腸桿菌是一種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli.，ETEC），它可以通過菌毛粘附在小腸上皮細(xì)胞上，產(chǎn)生腸毒素，并在死亡溶解后釋放內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)而引起仔豬腹瀉、水腫、死亡，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了巨大損失。目前研究發(fā)現(xiàn)，TLR4(Toll like receptor4)是將LPS的刺激信號(hào)直接傳入細(xì)胞內(nèi)的一種最重要的跨膜模式識(shí)別受體(Patter

2、n recognition receptor，PRR)。TLR4主要通過識(shí)別LPS，經(jīng)髓樣分化因子（Myeloid differentiation primary response protein88，MyD88）蛋白與白介素1類受體(Interleukin-1 receptor，IL-1R)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑重合，最終導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclearfactorκb，NF-κB)的激活，引起各種炎癥因子基因表達(dá)，促使F18大腸桿菌引起仔豬腹瀉

3、和水腫。鑒于TLR4在機(jī)體天然免疫與特異性免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)揮的重要作用，本試驗(yàn)將其作為豬抗病育種的候選基因進(jìn)行研究，從DNA、mRNA和細(xì)胞水平對(duì)豬TLR4基因的功能進(jìn)行探討和分析，主要結(jié)果如下:
　　1.采用PCR-SSCP方法對(duì)亞洲野豬、3個(gè)引進(jìn)的商業(yè)化品種和10個(gè)中國地方豬品種共893個(gè)個(gè)體TLR4基因外顯子1的遺傳變異進(jìn)行了檢測，旨在系統(tǒng)分析國內(nèi)外豬種TLR4基因的多態(tài)性，為探討該基因在免疫和防御系統(tǒng)中發(fā)揮的作用提供依據(jù)。

4、結(jié)果，在豬TLR4基因外顯子1中分離到新的突變位點(diǎn)，共檢測到3個(gè)等位基因，6種基因型。其中杜洛克檢測到AA、BB、CC、AB、AC、BC基因型，有杜洛克血統(tǒng)的蘇太豬中檢測到BB、CC、BC基因型，長白豬、約克夏中檢測到CC、BC基因型，野豬及所有10個(gè)中國地方豬品種TLR4基因外顯子1高度保守，只檢測到CC基因型，中國地方豬品種和引進(jìn)品種TLR4基因外顯子1多態(tài)性存在極顯著的差異。3種基因型中CC型與 GenBank中的序列一致，BB型

5、為G93C同義突變，而AA基因型存在G194A同無義突變位點(diǎn)，這2個(gè)變異位點(diǎn)與個(gè)體抗逆性和一般抗病力的關(guān)系值得進(jìn)一步深入研究。
　　2.用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測TLR4的組織表達(dá)譜及其在蘇太豬F18大腸桿菌抗性型群體和敏感型群體的表達(dá)差異，結(jié)果表明:TLR4基因在所檢測的仔豬11個(gè)組織中均表達(dá)，在肺、淋巴結(jié)、腎臟和脾臟等免疫器官中表達(dá)量較高，在肺中表達(dá)量最高;在F18大腸桿菌抗性群體和敏感性群體中，F(xiàn)18大腸桿菌敏感型個(gè)體的TL

6、R4基因表達(dá)量普遍高于抗性型個(gè)體的表達(dá)量，在各個(gè)組織中（除胃外）TLR4表達(dá)量差異倍數(shù)從1.171到2.598不等，表明，TLR4基因通過固有免疫識(shí)別機(jī)制，對(duì)豬F18大腸桿菌等革蘭氏陰性疾病有一定的影響，TL R4基因表達(dá)量的下調(diào)與F18大腸桿菌的抗性具有一定程度的關(guān)系。
　　3.利用LPS誘導(dǎo)豬小腸上皮細(xì)胞，檢測TLR4/MyD88信號(hào)通路基因的表達(dá)變化，0.1μg/mLLPS刺激IPEC后，TLR4、CDI4、MyD88、TN

7、F-α、IL-1β和IFN-α的表達(dá)量都極顯著升高(P＜0.01)，并在刺激后的2、4、6小時(shí)呈階梯增長;1μg/mL LPS刺激IPEC后，TLR4、CD14、MyD88、TNF-α、IL-1β和IFN-α都明顯升高且差異極顯著(P＜0.01)，并在刺激后的4到6小時(shí)間增長顯著。實(shí)驗(yàn)表明，在IPEC中，TLR4參與LPS激發(fā)的固有免疫應(yīng)答機(jī)制，這一免疫通路將促進(jìn)F18大腸桿菌的致病性，因此TLR4基因是豬F18大腸桿菌抗性育種的重要功