TLR4基因?qū)嗄套胸iF18大腸桿菌抗性調(diào)節(jié)機制的初步分析.pdf

1、F18大腸桿菌是一種產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli.，ETEC），它可以通過菌毛粘附在小腸上皮細胞上，產(chǎn)生腸毒素，并在死亡溶解后釋放內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)而引起仔豬腹瀉、水腫、死亡，給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成了巨大損失。目前研究發(fā)現(xiàn)，TLR4(Toll like receptor4)是將LPS的刺激信號直接傳入細胞內(nèi)的一種最重要的跨膜模式識別受體(Patter

2、n recognition receptor，PRR)。TLR4主要通過識別LPS，經(jīng)髓樣分化因子（Myeloid differentiation primary response protein88，MyD88）蛋白與白介素1類受體(Interleukin-1 receptor，IL-1R)信號轉(zhuǎn)導途徑重合，最終導致核轉(zhuǎn)錄因子(Nuclearfactorκb，NF-κB)的激活，引起各種炎癥因子基因表達，促使F18大腸桿菌引起仔豬腹瀉

3、和水腫。鑒于TLR4在機體天然免疫與特異性免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)揮的重要作用，本試驗將其作為豬抗病育種的候選基因進行研究，從DNA、mRNA和細胞水平對豬TLR4基因的功能進行探討和分析，主要結(jié)果如下:
　　1.采用PCR-SSCP方法對亞洲野豬、3個引進的商業(yè)化品種和10個中國地方豬品種共893個個體TLR4基因外顯子1的遺傳變異進行了檢測，旨在系統(tǒng)分析國內(nèi)外豬種TLR4基因的多態(tài)性，為探討該基因在免疫和防御系統(tǒng)中發(fā)揮的作用提供依據(jù)。

4、結(jié)果，在豬TLR4基因外顯子1中分離到新的突變位點，共檢測到3個等位基因，6種基因型。其中杜洛克檢測到AA、BB、CC、AB、AC、BC基因型，有杜洛克血統(tǒng)的蘇太豬中檢測到BB、CC、BC基因型，長白豬、約克夏中檢測到CC、BC基因型，野豬及所有10個中國地方豬品種TLR4基因外顯子1高度保守，只檢測到CC基因型，中國地方豬品種和引進品種TLR4基因外顯子1多態(tài)性存在極顯著的差異。3種基因型中CC型與 GenBank中的序列一致，BB型

5、為G93C同義突變，而AA基因型存在G194A同無義突變位點，這2個變異位點與個體抗逆性和一般抗病力的關(guān)系值得進一步深入研究。
　　2.用實時熒光定量PCR法檢測TLR4的組織表達譜及其在蘇太豬F18大腸桿菌抗性型群體和敏感型群體的表達差異，結(jié)果表明:TLR4基因在所檢測的仔豬11個組織中均表達，在肺、淋巴結(jié)、腎臟和脾臟等免疫器官中表達量較高，在肺中表達量最高;在F18大腸桿菌抗性群體和敏感性群體中，F(xiàn)18大腸桿菌敏感型個體的TL

6、R4基因表達量普遍高于抗性型個體的表達量，在各個組織中（除胃外）TLR4表達量差異倍數(shù)從1.171到2.598不等，表明，TLR4基因通過固有免疫識別機制，對豬F18大腸桿菌等革蘭氏陰性疾病有一定的影響，TL R4基因表達量的下調(diào)與F18大腸桿菌的抗性具有一定程度的關(guān)系。
　　3.利用LPS誘導豬小腸上皮細胞，檢測TLR4/MyD88信號通路基因的表達變化，0.1μg/mLLPS刺激IPEC后，TLR4、CDI4、MyD88、TN

7、F-α、IL-1β和IFN-α的表達量都極顯著升高(P＜0.01)，并在刺激后的2、4、6小時呈階梯增長;1μg/mL LPS刺激IPEC后，TLR4、CD14、MyD88、TNF-α、IL-1β和IFN-α都明顯升高且差異極顯著(P＜0.01)，并在刺激后的4到6小時間增長顯著。實驗表明，在IPEC中，TLR4參與LPS激發(fā)的固有免疫應(yīng)答機制，這一免疫通路將促進F18大腸桿菌的致病性，因此TLR4基因是豬F18大腸桿菌抗性育種的重要功