BPI基因對斷奶仔豬F18大腸桿菌抗性的功能分析.pdf

1、斷奶仔豬腹瀉和水腫病是兩種導致斷奶仔豬死亡的重要傳染性疾病，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。大腸桿菌F18菌株是引起這兩種疾病的主要病原菌，從長遠來看，從遺傳角度上提高豬對大腸桿菌F18菌株的抗性，并結合免疫接種控制疾病是一種高效可行的方法。因此，找到能適用于中國地方豬種的F18大腸桿菌抗性功能基因和相關遺傳標記具有十分重要的意義。殺菌通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasingprotein，

2、BPI)不但能夠殺滅革蘭氏陰性菌、中和內(nèi)毒素或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的活性，還可以促進補體活化，增強吞噬的調理功能等一系列生物學活性，在動物機體的天然防御中起到了很重要的作用。本試驗從群體、DNA、mRNA和蛋白水平分析了BPI基因對豬抗F18大腸桿菌感染的功能及機理，以期為今后利用其作為遺傳標記開展豬抗病育種提供參考和依據(jù)。主要結果如下:
　　 1.采用PCR-RFLP方法對野豬和國內(nèi)外10個豬

3、群體BPI基因第10外顯子HpaⅡ酶切位點遺傳變異進行了檢測，共檢測到AA、BB和AB3種基因型，2個等位基因，其中野豬、藏豬、榮昌豬和淮豬群體中AA基因型為優(yōu)勢基因型，A等位基因為優(yōu)勢等位基因;外來商業(yè)化豬品種中，杜洛克群體AA基因型頻率較高。序列分析表明AA基因型與GenBank中的序列一致，BB基因型存在A27G同義突變位點和T118G錯義突變位點?；贐PI基因的等位基因頻率構建11個豬群體的系統(tǒng)發(fā)生樹，將11個豬群體分為兩大類

4、:第一類包括野豬、淮豬、藏豬、榮昌豬、杜洛克;第二類包括大白豬、長白豬、楓涇豬、梅山豬、二花臉、蘇太豬。本研究結果顯示豬群體間基于BPI基因在一般抗性上確實存在差異，這種差異與體型、生產(chǎn)類型等因素沒有明顯的聯(lián)系。對BPI基因第10外顯子HpaⅡ酶切位點3種基因型個體大腸桿菌F18菌株抗性/易感性進行分析，結果發(fā)現(xiàn)，AA基因型中大腸桿菌F18菌株抗性型個體的頻率為90％，顯著或極顯著地高于AB基因型(57.1％)和BB基因型(17.4％)

5、的個體，表明BPI基因第10外顯子HpaⅡ酶切位點AA基因型對大腸桿菌F18菌株抗性是有利基因型。
　　 2.利用課題組前期建立的F18大腸桿菌病抗性和敏感性資源群體，篩選出性狀基本一致的抗性型以及敏感型個體各8頭，運用Real-timePCR方法研究在斷奶仔豬中BPI基因mRNA的各個組織表達水平，并比較其在大腸桿菌F18菌株抗性和敏感性斷奶仔豬個體間的差異表達情況;同時選取蘇太豬不同日齡(8日齡、18日齡、30日齡和35日齡

6、)仔豬各8頭，不同品種(梅山豬、大白豬和蘇太豬抗性群體)斷奶仔豬各8頭，分析BPI基因在初生到斷奶不同發(fā)育時期以及在不同群體間的表達水平。結果表明，在對所有個體檢測的11個組織中，BPI基因在心、肝、脾、肺、腎、胃、肌肉、胸腺、淋巴結中幾乎不表達或表達量很低，但在十二指腸和空腸中表達量很高。在十二指腸和空腸中，BPI基因在抗性組的表達量均顯著高于敏感組的表達量(P＜0.05)。在8日齡，18日齡，30日齡和35日齡4個不同發(fā)育時期的蘇太

7、豬中，結果發(fā)現(xiàn)空腸和十二指腸在4個不同發(fā)育時期均高度表達。在空腸組織中35日齡表達量顯著高于18日齡表達量(P＜0.05)，在8日齡、18日齡和30日齡之間表達量差異不顯著(P＞0.05)。十二指腸中35日齡表達量顯著高于8日齡、18日齡和30日齡的表達量(P＜0.05)，8日齡、18日齡和30日齡之間表達量差異不顯著(P＞0.05)。梅山豬、大白豬和蘇太豬抗性型群體之間BPI基因表達實驗的結果顯示，空腸和十二指腸在3個群體中都高度表達

8、，且BPI基因在蘇太豬抗性型群體中的表達量顯著高于大白豬和梅山豬的表達量(P＜0.05)。綜上可見，BPI基因對抗斷奶仔豬腸道中大腸桿菌F18菌株的感染可能具有直接作用，并且個體對大腸桿菌F18菌株的抗性可能與BPI基因在腸道中表達量上調有關。
　　 3.分析BPI基因第10外顯子HpaⅡ酶切位點3種基因型在空腸和十二指腸中的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)，AA基因型在空腸和十二指腸中的表達量要顯著高于BB和AB基因型的表達量(P＜0.05

9、)。因此，進一步推測BPI基因AA基因型對抗大腸桿菌F18菌株引起的斷奶仔豬腹瀉與水腫病具有直接的作用，個體對大腸桿菌F18菌株的抗性與BPI基因在腸道中表達量上調有關。豬BPI基因外顯子10HpaⅡ酶切位點AA基因型有望作為抗大腸桿菌F18菌株的遺傳標記，用于抗大腸桿菌F18菌株等革蘭氏陰性菌病的育種實踐。
　　 4.蘇太豬中BPI基因外顯子10HpaⅡ酶切位點多態(tài)性與部分免疫指標關聯(lián)分析結果發(fā)現(xiàn)，AA基因型個體IL-12水平

10、顯著低于AB基因型個體(P＜0.05)，也低于BB基因型個體，但是差異不顯著(P＞0.05)，其他細胞因子的水平在3種基因型間差異不顯著(P＞0.05)，初步推斷AA基因型個體可能具有較強的免疫應答能力，至少對于一般抗病力沒有不利影響，利用其作為抗大腸桿菌F18的分子標記進行抗病育種具有可行性。
　　 5.為了在體外研究BPI蛋白表達情況及其抑菌功能，本研究成功構建了酵母表達載體、原核表達載體和哺乳動物表達載體。通過對表達條件的

11、優(yōu)化，酵母表達載體和原核表達載體均未能在表達菌株中檢測到重組蛋白的表達，這可能是由于BPI蛋白強烈的抑菌作用造成的。最終在293-6E細胞培養(yǎng)上清中檢測到BPI重組蛋白的表達，并對BPI重組蛋白進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)BPI的理化性質、蛋白的二級和三級結構都和預定結果一致。此外，還發(fā)現(xiàn)豬BPI分子可能是由胞外區(qū)(35-485aa)、跨膜區(qū)(12-34aa)和胞內(nèi)區(qū)(1-11aa)3部分組成。BPI屬于分泌蛋白，主要在線粒體(44.4％)