F18大腸桿菌群體感應(yīng)基因luxS功能研究.pdf

1、F18大腸桿菌是引起仔豬水腫病和仔豬腹瀉的主要病原菌，而仔豬水腫病和仔豬腹瀉是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疾病。F18大腸桿菌的致病性與其毒力因子密切直接相關(guān)，而這些毒力因子共同作用于宿主機(jī)體，發(fā)揮毒力致病作用，造成機(jī)體損害。毒力因子受到嚴(yán)格調(diào)控，而群體感應(yīng)系統(tǒng)參與了這一調(diào)控過程。本試驗(yàn)研究探索了F18大腸桿菌F18ab參考株107/86株群體感應(yīng)系統(tǒng)及l(fā)uxS基因介導(dǎo)的相關(guān)功能。
　　 在細(xì)菌生長過程中，能夠釋放特定信號(hào)分子，使細(xì)菌可以感

2、知周邊環(huán)境中的同類數(shù)量，以此來調(diào)節(jié)自身多種基因的表達(dá)，這種現(xiàn)象稱為群體感應(yīng)(QuorumSensing)，而這類信號(hào)分子稱為自體誘導(dǎo)子(Autoinducer，AI)。在Ⅱ型群體感應(yīng)系統(tǒng)中，luxS和pfs兩基因是重要相關(guān)基因，在AI-2合成中起著重要作用。為了驗(yàn)證F18大腸桿菌107/86參考株中是否存在Ⅱ型群體感應(yīng)系統(tǒng)，根據(jù)GenBank中已經(jīng)報(bào)道的E.coli K12株luxS和pfs基因序列，設(shè)計(jì)出相應(yīng)引物對(duì)，成功擴(kuò)增出107/

3、86參考株的luxS和pfs基因，測序后發(fā)現(xiàn)與K12株序列有高度同源性，從而證明107/86株可能存在群體感應(yīng)Ⅱ型系統(tǒng)。鑒于AI-2分子可以誘導(dǎo)報(bào)告菌BB170發(fā)生生物發(fā)光反應(yīng)并能定量分析檢測AI-2分子表達(dá)水平，利用這種方法同樣檢測出107/86株培養(yǎng)上清能夠誘導(dǎo)生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)，而大腸桿菌工程菌DH5a培養(yǎng)上清不能誘導(dǎo)生物發(fā)光，從而證明107/86株能夠合成AI-2分子，存在群體感應(yīng)Ⅱ型系統(tǒng)，而DH5a不能合成AI-2分子和群體感應(yīng)Ⅱ型

4、系統(tǒng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證luxS基因在AI-2合成中的作用，利用限制性內(nèi)切酶雙酶切技術(shù)將luxS基因連接入pBR322質(zhì)粒，構(gòu)建成互補(bǔ)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入群體感應(yīng)系統(tǒng)陰性菌DH5a，發(fā)現(xiàn)其獲得一定程度的AI-2合成能力和誘導(dǎo)BB170生物發(fā)光的能力。在pH7.5和37℃時(shí)，107/86株AI-2分子達(dá)到最高表達(dá)水平，pH或溫度的提高或降低都會(huì)使得AI-2表達(dá)水平下降。培養(yǎng)基中加入0.5％葡萄糖，可使107/86株AI-2表達(dá)水平增加一倍，而在培養(yǎng)基

5、中加入0.5％氯化鈉和蔗糖并不能誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生這種現(xiàn)象。對(duì)數(shù)生長期時(shí)107/86株AI-2水平迅速上升，但一旦進(jìn)入穩(wěn)定期，AI-2水平迅速下降。通過對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌、耶爾森氏菌、多殺性巴氏桿菌等細(xì)菌的LuxS蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)LuxS蛋白在上述不同種屬細(xì)菌中具有相當(dāng)高的同源性，從而在序列同源性上驗(yàn)證了群體感應(yīng)Ⅱ型系統(tǒng)屬于種間系統(tǒng)，即不同種屬細(xì)菌分泌的AI-2分子可以對(duì)其他種屬細(xì)菌進(jìn)行調(diào)控。
　　 基于大腸桿菌F1

6、8ab107/86株luxS基因的已知序列，本試驗(yàn)對(duì)luxS基因采用RED同源重組技術(shù)進(jìn)行了敲除。首先合成一對(duì)引物(每一條引物5’端與luxS基因同源，而3’端與pKD3質(zhì)粒帶有的氯霉素抗性基因cat同源)，從而得到了具有氯霉素抗性基因并帶有同源臂的PCR產(chǎn)物，然后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌F18ab107/86株中，利用Red重組系統(tǒng)中的pKD46表達(dá)的三種重組酶，氯霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物通過其兩側(cè)的luxS基因同源序列與大腸桿菌染色體上的基因

7、發(fā)生同源重組，通過氨芐青霉素和氯霉素雙抗性LB平板篩選得到陽性一次重組菌，轉(zhuǎn)化編碼Flp重組酶進(jìn)行專一性FRT位點(diǎn)重組的質(zhì)粒pCP20，得到二次重組菌并去除了抗性篩選基因，結(jié)合PCR擴(kuò)增和測序結(jié)果，證明luxS基因缺失株107/86△luxS的正確構(gòu)建。上述缺失株的成功構(gòu)建，為進(jìn)一步深入研究群體感應(yīng)系統(tǒng)與機(jī)體毒力因子相互作用的分子機(jī)制，細(xì)菌的致病機(jī)理及對(duì)國內(nèi)仔豬水腫病的防控策略奠定了一定的基礎(chǔ)。
　　 為了進(jìn)一步研究群體感應(yīng)系統(tǒng)

8、對(duì)大腸桿菌毒力因子的調(diào)控，我們將表達(dá)luxS基因的pBR322質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入缺失株107/86△luxS，構(gòu)建了互補(bǔ)株，以野生株、缺失株、互補(bǔ)株的體系對(duì)luxS基因功能進(jìn)行研究?；パa(bǔ)株的上清可以誘導(dǎo)BB170生物發(fā)光，證明互補(bǔ)株確實(shí)恢復(fù)了AI-2活性。通過生長曲線，發(fā)現(xiàn)野生株在對(duì)數(shù)期的生長速率略高于缺失株和互補(bǔ)株。野生株、缺失株、互補(bǔ)株在IMVIC生化試驗(yàn)、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖等糖分解利用上并無定性差異。F18大腸桿菌通過F18菌毛等粘附

9、素粘附于腸上皮細(xì)胞，進(jìn)行定居增殖，菌毛是F18大腸桿菌首要毒力因子。試驗(yàn)表明，缺失株對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞系IPEC-J2的粘附能力比起野生株和互補(bǔ)株有所下降，約37％。Stx2e是F18大腸桿菌的重要毒力因子，通過與腸上皮細(xì)胞Gb5受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞病變，而Vero細(xì)胞對(duì)Stx2e毒素敏感。通過結(jié)晶紫法定量檢測Stx2e毒素作用后殘存細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)將缺失株分泌的Stx2e毒素加入Vero細(xì)胞后，殘存的Vero細(xì)胞數(shù)量相比野生株和互補(bǔ)株提高約20