Wnt-β-catenin信號(hào)通路功能低下在糖尿病合并創(chuàng)面難愈中的作用.pdf

1、目的：糖尿病患者皮膚易受損傷，損傷后創(chuàng)面愈合延遲或不愈合。在糖尿病人群中足部潰瘍的發(fā)生率為2%，糖尿病患者一生中的15％會(huì)罹患此并發(fā)癥。糖尿病潰瘍預(yù)后較差，3年生存率在50％左右。既往研究認(rèn)為，糖尿病合并創(chuàng)面難愈的因素主要集中在以下幾方面：①糖代謝紊亂及晚期糖基化終末產(chǎn)物增多；②微血管改變；③基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）在糖尿病患者致傷前后的表達(dá)異常；④表皮生長因子受體的改變；⑤表皮細(xì)胞增

2、殖障礙。而目前基于以上機(jī)制用于治療糖尿病潰瘍的藥物均未成功，僅有重組PDGF（recombinant platelet—derived growth factor）療效較好。創(chuàng)面愈合過程中任何一個(gè)環(huán)節(jié)不協(xié)調(diào)或功能障礙均可導(dǎo)致創(chuàng)面愈合失控。目前關(guān)于糖尿病創(chuàng)面難愈的機(jī)制仍未闡明。Wnt細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是調(diào)控細(xì)胞生長、發(fā)育和分化的關(guān)鍵途徑。此信號(hào)途徑中的關(guān)鍵因子β—catenin穩(wěn)定性以及其在細(xì)胞內(nèi)的位置受到一系列正性調(diào)節(jié)因子和負(fù)性調(diào)節(jié)因子的

3、調(diào)控，其調(diào)控異常可導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的抑制或異常激活，從而產(chǎn)生基因表達(dá)、細(xì)胞黏連、發(fā)育方面等一系列異常，并與癌癥發(fā)生、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。Wnt信號(hào)途徑與PGE2/EP2信號(hào)、EGF/EGFR/PI—3K/AKT以及鈣粘蛋白E—cadherin信號(hào)調(diào)控途徑之間存在較為復(fù)雜的crosstalk系統(tǒng)。最新的研究發(fā)現(xiàn)，Wnt以及β—catenin表達(dá)增強(qiáng)，表皮細(xì)胞的增殖、分化和遷移能力增強(qiáng)，且創(chuàng)面愈合加快；皮膚角質(zhì)化細(xì)胞Wnt信號(hào)途徑影響創(chuàng)傷后皮膚

4、的厚度及色素沉著；Wnt信號(hào)途徑參與保護(hù)高糖導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷；β—catenin調(diào)控異常可以促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡；Chun—LiangLin等報(bào)道，Wnt/β—catenin信號(hào)的上調(diào)能提高高糖抑制的腎系膜細(xì)胞的活性；高糖通過PI3K—Akt信號(hào)途徑抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移和增殖及血管發(fā)生改變，也能引起黏附分子E—cadherin的上調(diào)：我們的初步研究提示，經(jīng)高糖處理的內(nèi)皮祖細(xì)胞β—catenin、EGFR和周期素D1表達(dá)減弱。從這些間接

5、資料推測出，糖尿病的創(chuàng)面難愈與Wnt/β—catenin信號(hào)通路功能紊亂有關(guān)。因而，本研究擬對此進(jìn)行探討。 方法：1．糖尿病難愈創(chuàng)面大鼠模型的建立：①1型糖尿病大鼠模型的建立：選擇3月齡體重范圍為201～240g清潔級SD雄性大鼠，禁食12h后以50mg/kgSTZ（鏈脲佐菌素）液一次性腹腔注射，于注射后第1、3、14d對動(dòng)物的血糖進(jìn)行測定，注射3d后動(dòng)物血糖濃度>16．65 mmol/L判定為1型糖尿病動(dòng)物模型。②制作大鼠背部

6、皮膚缺損：取上述人工復(fù)制的糖尿病大鼠60只和正常大鼠20只，以3%戊巴比妥鈉（25 mg/kg）腹腔推注麻醉后，背部剃毛，常規(guī)消毒。在無菌條件下用特制打孔器在鼠背中部脊柱兩側(cè)各打一圓孔，深至皮下，直徑1．8cm，創(chuàng)面面積為2．54 c㎡。止血后以無菌紗布包扎，換藥1次/天，單籠喂養(yǎng)，定量飲水與喂食。所有實(shí)驗(yàn)均在清潔級動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成；2．處理對照組與實(shí)驗(yàn)組：本實(shí)驗(yàn)分為正常組、糖尿病組、糖尿病+氯化鋰組、糖尿病+EGF組，共四組，每組各20

7、只大鼠，①正常組及糖尿病組，正常喂養(yǎng)，記錄每日飲水量、進(jìn)食量、尿量及體重變化；②糖尿病+氯化鋰組，除同上處理外，自糖尿病大鼠背部皮膚缺損模型制作成功之日即給予1/20LD50氯化鋰（灌胃給藥，LD50：526mg/kg），1次/d；③糖尿病+EGF組，用無菌注射器抽取rhEGF10ug滴加在無菌紗布上并覆蓋創(chuàng)面，凡士林紗布、無菌紗布及繃帶包扎固定，每日以相同方法換藥一次；④傷后3d、7d檢測各組創(chuàng)面細(xì)菌學(xué)變化（每平方厘米創(chuàng)面菌落數(shù)的常用

8、對數(shù)），以排除細(xì)菌因素對創(chuàng)面修復(fù)的延遲作用；3．觀察背部創(chuàng)面愈合情況：①創(chuàng)面形態(tài)學(xué)描述：濕潤度、顏色、分泌物、形狀、創(chuàng)緣及50%創(chuàng)面愈合時(shí)間；②創(chuàng)面面積：傷后即刻及3、7、14 d用透明膜覆蓋創(chuàng)面沿創(chuàng)緣畫膜，剪膜，置分度值為0．1mg的分析天平稱重?fù)Q算成面積，并計(jì)算創(chuàng)面愈合率；⑧傷腔容積：傷后即刻及3、7d用1 ml注射器向傷腔內(nèi)滴注生理鹽水，至液面與創(chuàng)緣皮膚相平為止，記錄注入量；④組織病理學(xué)檢查，傷后14 d取創(chuàng)面組織HE染色，以成纖

9、維細(xì)胞增生、毛細(xì)血管增生、表皮增生為指標(biāo)觀察；4．檢測β—catenin表達(dá)情況（多少強(qiáng)弱，分布區(qū)域）：采用SP免疫組織化學(xué)方法。判定標(biāo)準(zhǔn)：在10×20倍顯微鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，免疫組化陽性信號(hào)為棕黃色顆粒狀，觀察陽性信號(hào)的染色強(qiáng)度、部位并計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)。按照Maruyama等的方法，觀察β—catenin在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核三個(gè)部位的表達(dá)強(qiáng)度判斷，細(xì)胞膜>70%陽性為正常表達(dá)，反之為表達(dá)缺失，細(xì)胞質(zhì)或

10、細(xì)胞核>10%陽性為異位表達(dá)，細(xì)胞膜正常表達(dá)視為β—catenin陰性，細(xì)胞膜表達(dá)缺失或出現(xiàn)異位表達(dá)視為β—catenin陽性。 結(jié)果：1．動(dòng)物模型的穩(wěn)定性，對糖尿病大鼠血糖水平的監(jiān)測顯示，大鼠血糖水平一直維持在21．23—24．60mmol/L，致傷前后不同時(shí)間糖尿病各組間差異無顯著意義，符合模型制作標(biāo)準(zhǔn)；2．正常組大鼠每日飲水量、進(jìn)食量及尿量均較糖尿病三組大鼠少，體重增加變化較糖尿病組大鼠明顯，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；糖尿病各組大

11、鼠無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；3．傷后觀察各組大鼠創(chuàng)面，未見感染征象，傷后3d、7d檢測各組創(chuàng)面細(xì)菌學(xué)變化，組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，排除細(xì)菌因素對創(chuàng)面修復(fù)的延遲作用；4．正常組、糖尿病+氯化鋰組及糖尿病+EGF組大鼠創(chuàng)面干燥、紅潤，分泌物少，創(chuàng)緣形狀不規(guī)則，收縮明顯，正常組大鼠50%創(chuàng)面愈合時(shí)間為5．5d，糖尿病+氯化鋰組為5．9d，糖尿病+EGF組為5．7d，此三組間無顯著差異，均較糖尿病組明顯縮短（P<0．05），至傷后14天，此三組創(chuàng)面大部分均已完全

12、愈合；糖尿病組大鼠創(chuàng)面潮濕，呈暗紅色，有少許分泌物，形狀多為橢圓形，創(chuàng)面凹陷，皮膚收縮不明顯，隨著傷后時(shí)間延長，創(chuàng)面面積略有縮小，但其50%創(chuàng)面愈合時(shí)間約在傷后9天，至傷后14天，仍有6個(gè)創(chuàng)面未愈合；5．傷后第3、7、14d，正常組、糖尿病+氯化鋰組及糖尿病+EGF組間，創(chuàng)面愈合率無顯著差異，但均較糖尿病組高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；傷后第1d，四組間創(chuàng)面愈合率無顯著差異；6．傷后第3、7d，正常組、糖尿病+氯化鋰組及糖尿病+EGF組間，傷腔

13、容積縮小無顯著差異，但均較糖尿病組縮小明顯（P<0．05）；傷后第1d，四組間傷腔容積變化無顯著差異；7．傷后14 d取創(chuàng)面組織HE染色，正常組、糖尿病+氯化鋰組及糖尿病+EGF組，表皮增生并覆蓋創(chuàng)面，肉芽組織趨于成熟，成纖維細(xì)胞較豐富，膠原致密、排列整齊，毛細(xì)血管與創(chuàng)面垂直，組間無顯著差異；糖尿病組表皮不同程度增生，大部分未完全覆蓋創(chuàng)面，肉芽組織疏松，新生表皮下毛細(xì)血管較多，少量炎性細(xì)胞浸潤，與上三組差別明顯；8．傷后第3、7、14d

14、，正常組、糖尿病+氯化鋰組及糖尿病+EGF組，β—catenin細(xì)胞膜著色相對減少，出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)粗細(xì)不等，數(shù)量不一的棕黃色陽性顆粒著色，β—catenin陽性細(xì)胞率三組間無顯著差異，但與糖尿病組比較，陽性細(xì)胞率高，差異顯著，而糖尿病組大鼠創(chuàng)面β—catenin圍繞細(xì)胞膜呈連續(xù)細(xì)線狀棕黃色染色，陽性細(xì)胞數(shù)明顯較少。 結(jié)論：1．糖尿病大鼠創(chuàng)面，β—catenin陽性細(xì)胞率比正常大鼠創(chuàng)面低，提示糖尿病大鼠在創(chuàng)面愈合的過程中Wnt/β—c