骨形成蛋白信號通路在肺動脈高壓血管重構(gòu)中的作用及機制研究.pdf

1、肺動脈高壓(Pulmonary Arterial Hypertension，PAH)是以肺動脈壓力增高為特征的一類疾病,其發(fā)病機制至今仍不明了。已知血管重構(gòu)是肺動脈高壓的重要病理特征,其主要病理改變是血管平滑肌層增厚造成管腔狹窄、閉塞。肺血管重構(gòu)可引起肺動脈壓力升高,肺血管阻力增大而加重右心室后負荷,嚴重時導(dǎo)致右室肥厚、心力衰竭甚至死亡。延緩肺血管重構(gòu),改善心肺功能是藥物治療肺動脈高壓,提高患者生存率的關(guān)鍵靶點。
　　骨形成蛋白(

2、Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)信號通路與肺動脈高壓的發(fā)病密切相關(guān)。骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPR-Ⅱ)基因突變是導(dǎo)致遺傳性肺動脈高壓的主要發(fā)病因素,也與特發(fā)性肺動脈高壓患者有關(guān)。BMP信號通路失調(diào)被認為是肺動脈高壓的重要發(fā)病原因。但是BMPR-Ⅱ基因敲除小鼠并不一定發(fā)生肺動脈高壓,提示可能另有BMP信號通路下游效應(yīng)蛋白在發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用,或者存在第二重打擊而觸發(fā)PAH的發(fā)病過程。Id蛋白是BMP信號

3、通路的主要下游蛋白,在組織發(fā)育,細胞分化,細胞周期調(diào)控等方面扮演十分重要的角色。本論文第一章將探討B(tài)MPR-Ⅱ突變對Id蛋白的影響及其在調(diào)節(jié)肺動脈平滑肌細胞增殖功能中的作用。
　　藥物治療是目前臨床治療肺動脈高壓的主要手段,常用藥物包括前列環(huán)素類藥物,磷酸二酯酶5 (PDE5)抑制藥,內(nèi)皮素(ET)受體抑制藥以及鈣離子通道拮抗藥(CCB)等幾大類,主要通過抑制血管收縮,改善血管舒張功能,延緩血管重構(gòu)和肌化等而發(fā)揮作用,但其療效并不

4、十分滿意。本文在確證BMP信號通路在調(diào)節(jié)PASMCs增殖功能中起重要作用的基礎(chǔ)上,將從在體和離體兩個水平進一步研究BMP信號通路在肺動脈高壓藥物治療中的作用并探討其作為藥物治療靶點的研究前景。
　　第一章Id蛋白介導(dǎo)BMP對肺動脈平滑肌細胞功能的調(diào)節(jié)
　　第一節(jié)BMPR-Ⅱ介導(dǎo)BMP誘導(dǎo)的Id蛋白表達
　　研究背景：肺動脈高壓發(fā)病機制至今仍不明了。血管重構(gòu)被認為是肺動脈高壓的重要病理特征,肺小血管肌化可引起肺血管阻力增

5、加,肺動脈壓力升高并最終導(dǎo)致失代償性心衰甚至死亡。肺動脈平滑肌細胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)的過度增殖是引起血管重構(gòu)的關(guān)鍵因素。越來越多的研究以肺血管重構(gòu)機制為關(guān)注點,臨床治療也多以改善血管重構(gòu),延緩肺動脈高壓病程,提高患者生存率為目的。骨形成蛋白(Bone morphogenetic proteins，BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子(Transforming Growth

6、Factor，TGF)超家族成員之一。BMP可結(jié)合位于細胞膜上的絲氨酸/絡(luò)氨酸受體復(fù)合物(由BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ組成),進而磷酸化激活胞內(nèi)Smad信號分子,Smads入核啟動下游基因表達。研究發(fā)現(xiàn),骨形成蛋白Ⅱ型受體(BMPR—Ⅱ)突變是導(dǎo)致遺傳性肺動脈高壓的主要發(fā)病因素,也發(fā)現(xiàn)于25％左右的特發(fā)性肺動脈高壓患者。在低氧誘導(dǎo)和野百合堿注射誘導(dǎo)的肺動脈高壓動物模型也發(fā)現(xiàn)BMPR-Ⅱ表達下調(diào),BMP信號通路功能受損。因此,BMP信號通

7、路被認為是PAH發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)節(jié)通路。但是,BMPR-Ⅱ基因敲除小鼠并不一定發(fā)生肺動脈高壓,提示BMPR-Ⅱ基因突變可能僅是肺動脈高壓發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)或易感因素,另有BMP信號通路下游效應(yīng)蛋白在發(fā)病過程中起關(guān)鍵作用,或者存在第二重打擊而觸發(fā)肺動脈高壓的發(fā)病過程。Id蛋白是BMP信號通路主要的下游蛋白,包括Id1-Id4四種亞型,其表達與功能各有不同。Idl和Id3被認為主要與血管生理有關(guān)。我們最近研究發(fā)現(xiàn),BMPR-Ⅱ基因缺失雜合型小

8、鼠肺組織Idl蛋白表達水平低于野生型小鼠,BMP抑制肺動脈平滑肌細胞增殖可能與Idl有關(guān),但是Id蛋白在BMP信號通路中的作用,BMPR-Ⅱ突變對Id蛋白的影響尚不明了。本研究主要以人肺動脈平滑肌細胞為研究對象,探討B(tài)MPR-Ⅱ在介導(dǎo)BMP誘導(dǎo)四種Id蛋白亞型的表達與功能中的作用。另外基于BMPR-Ⅱ+/-小鼠與野生型小鼠在常氧和低氧狀態(tài)下肺血管Id蛋白表達的差異,以及BMP信號通路激活十分迅速,Id蛋白上游Smad蛋白磷酸化在BMP刺

9、激后半小時左右即可發(fā)生并達到高峰,我們也觀察了BMP對Id蛋白調(diào)節(jié)的時間效應(yīng)。
　　方法：(1)BMPR-Ⅱ+/-小鼠與野生型小鼠肺組織提取及免疫組織化學(xué)分析WKY雄性小鼠,分設(shè)4組(n=5):野生型組(WT).BMPR-Ⅱ基因敲除組(BMPR-Ⅱ+/-).低氧野生型組(Hypoxia+WT).低氧BMPR-Ⅱ基因敲除組(Hypoxia+BMPR-Ⅱ+/-)。肺組織一部分行石蠟包埋,以備免疫組織化學(xué)檢測,一部分采用磁珠分選法分離培

10、養(yǎng)肺動脈平滑肌細胞。
　　(2)人肺動脈平滑肌細胞培養(yǎng),SiRNA干擾及RNA,蛋白檢測人肺動脈平滑肌細胞來源于肺移植病人或肺切除術(shù)患者,之前已作BMPR-Ⅱ基因型分析。常規(guī)以含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培基培養(yǎng)。不同因素處理后,提取細胞總RNA及蛋白進行相關(guān)檢測。SiRNA直接購于或合成于公司。
　　結(jié)果：1.BMP可誘導(dǎo)人肺動脈平滑肌細胞四種Id蛋白的表達;
　　2.SiRNA沉默BMPR-Ⅱ表達取消BMP

11、誘導(dǎo)的Id蛋白表達;
　　3.含BMPR-Ⅱ突變基因的人肺動脈平滑肌細胞Idl和Id3表達明顯低于BMPR-Ⅱ基因野生型正常細胞;
　　4.Id3蛋白主要表達于小鼠肺血管平滑肌層;常氧和低氧狀態(tài)下,BMPR-Ⅱ+/-小鼠Id3表達都明顯低于野生型小鼠;
　　5.BMP誘導(dǎo)Idl和Id3表達具有短期與長期兩次效應(yīng);
　　結(jié)論：BMPR-Ⅱ基因缺失抑制了人肺動脈平滑肌細胞Id蛋白的表達,BMPR-Ⅱ介導(dǎo)BMP誘導(dǎo)的I

12、d蛋白表達;BMP誘導(dǎo)Idl和Id3蛋白表達具有早期和長期效應(yīng)。
　　第二節(jié)Id蛋白介導(dǎo)BMP對PASMCs增殖和細胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)
　　研究背景：Id蛋白是一類轉(zhuǎn)錄因子,屬于莖-環(huán)-莖(Helix-Loop-Helix，HLH)大類。Id蛋白廣泛表達于人體各個組織,在胚胎發(fā)育,血管新生,細胞分化,細胞周期調(diào)控等多種事件中扮演重要角色。Id基因還被認為是促癌基因,是決定細胞命運的關(guān)鍵因子。研究發(fā)現(xiàn),Id蛋白在增殖細胞普遍

13、高水平表達,在非增殖細胞、沉默細胞表達量很低甚至缺失,提示Id蛋白參與細胞增殖功能的調(diào)節(jié)。研究表明,Id蛋白調(diào)控細胞增殖主要與其調(diào)節(jié)細胞周期有關(guān),調(diào)節(jié)點位于G1期入S期的時相階段。細胞周期依賴性激酶(cyclin dependent kinase，CDK)的抑制蛋白如p21和p27等是Id蛋白的主要調(diào)控對象。肺動脈平滑肌細胞增殖也受BMP信號通路的調(diào)控,但是具體機制不明,Id蛋白是否介導(dǎo)這一調(diào)節(jié),其作用是否與調(diào)控細胞周期有關(guān)等問題都有待

14、解決。本研究著眼于肺動脈平滑肌細胞增殖功能的調(diào)控,探討B(tài)MP/Id信號通路在調(diào)節(jié)PASMCs增殖和細胞周期相關(guān)蛋白表達的作用。
　　方法：人PASMCs常規(guī)培養(yǎng),觀察BMP對細胞增殖的影響。同時觀察BMP對細胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白如p21，p27，pRb的作用。之后以SiRNA干擾沉默Idl和Id3蛋白表達,探討Id蛋白在調(diào)節(jié)細胞周期、PASMCs增殖中的作用。
　　結(jié)果：1.細胞計數(shù)顯示,BMP4抑制野生型肺動脈平滑肌細胞的增

15、殖;
　　2. BMP4對BMPR-Ⅱ基因突變細胞增殖無明顯影響;
　　3.Westernblot實驗顯示,BMP4對PASMCs中P21蛋白表達的調(diào)節(jié)在野生型細胞和BMPR-II基因突變細胞存在差異;
　　4.SiRNA干擾有效抑制Id1和Id3表達;
　　5.Id1和Id3介導(dǎo)了BMP4對細胞周期相關(guān)蛋白P21和pRb蛋白的作用;
　　結(jié)論：Id1和Id3蛋白對細胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)控可能介導(dǎo)了BMP4對

16、肺動脈平滑肌細胞增殖的抑制作用。
　　第二章以BMP信號通路為靶點的藥物治療機制研究
　　第一節(jié)曲前列素治療肺動脈高壓與調(diào)節(jié)BMP信號通路有關(guān)
　　研究背景：肺動脈高壓患者死亡率高,生存率低,至今仍無特效治療方案。除了晚期進行肺移植手術(shù)之外,藥物治療仍然是絕大部分肺動脈高壓患者的主要治療手段。常用藥物包括前列環(huán)素類藥物,磷酸二酯酶5(Phosphodiesterase 5，PDE5)抑制藥,內(nèi)皮素(Endothelin

17、，ET)受體抑制藥以及鈣離子通道拮抗藥(Calcium channel block，CCB)等幾大類,主要發(fā)揮抑制血管收縮、改善血管舒張功能、延緩血管重構(gòu)和肌化等藥理作用。前列環(huán)素類藥物如曲前列素能在體內(nèi)激活腺苷酸環(huán)化酶(Adenyl cyclase，AC),促進環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine monophosphate，cAMP)的生成,達到舒張血管的作用。研究發(fā)現(xiàn),前列環(huán)素類藥物還具有改善肺血管重構(gòu)的作用,但是其作用機

18、制尚不明確。TGF信號通路在肺動脈高壓發(fā)病過程中的作用至今仍有爭議,一般認為其與BMIP信號通路作用相反,是維持血管穩(wěn)態(tài)平衡的兩個平衡端。本研究在以野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓大鼠模型,給予曲前列素治療,觀察其對肺動脈壓力、右心室功能、肺小血管肌化及重構(gòu)的影響?；诘谝徽卵芯堪l(fā)現(xiàn)BMP/Id信號通路在調(diào)節(jié)PASMCs增殖中的作用,本節(jié)也將進一步探討曲前列素對BMP/Id信號通路及TGF信號通路的影響及其意義。
　　方法：(1)野百合堿

19、誘導(dǎo)肺動脈高壓大鼠模型及藥物治療:雄性SD品系野生型大鼠,分為三個組別:對照組,野百合堿+治療空白對照組,野百合堿+曲前列素治療組。給予單次皮下細注射野百合堿(monocrotanine，MCT 60mg/kg)誘導(dǎo)肺動脈高壓模型。野百合堿注射三周后,背部皮下植入滲透性微泵注射曲前列素治療2周。藥物濃度0.15mg/ml,注射速度為45ng/kg/min。對照組給予等量等張生理鹽水。微泵植入時以芬太尼(300ug/kg)與曼陀羅堿(30

20、0ug/kg)麻醉大鼠,術(shù)后30分鐘動物復(fù)蘇。
　　(2)動物手術(shù)及組織提取:實驗終點時以戊巴比妥麻醉大鼠,行氣管切開呼吸機維持呼吸。左頸動脈插管監(jiān)測系統(tǒng)血壓,右心導(dǎo)管由右頸靜脈插入,監(jiān)測右心功能、肺血管阻力等指標。動物放血后,左肺存于10%福爾馬林以備組織學(xué)實驗,右肺速凍于液氮以備RNA、蛋白提取,心臟分離出右心室、左心室加室間隔稱重計算RV/(LV+S)比值。
　　結(jié)果：1.野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈壓力、右室收縮壓和肺血

21、管阻力明顯增高,血管重構(gòu)明顯,肺小血管肌化比例高,右心室顯著肥厚。曲前列素治療降低肺血管阻力、右室收縮壓,改善血管重構(gòu),肺小血管肌化及右心室肥厚。
　　2.免疫組織化學(xué)分析顯示,野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺組織Id1表達下調(diào),增殖細胞增多。曲前列素治療升高了Id1的表達,增殖細胞數(shù)目明顯減少。
　　3. Westernblot和Real-time PCR實驗顯示,野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺組織BMPR-II蛋白表達明顯減少,Smad1/5

22、磷酸化水平降低,Id1mRNA水平顯著下調(diào)。曲前列素不能恢復(fù)BMPR-II的表達,但是升高了Smad1/5磷酸化水平及Id1mRNA水平的表達。
　　4. Westernblot和Real-time PCR實驗顯示,野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺組織Smad3磷酸化水平升高,PAI-1mRNA水平上調(diào)。曲前列素治療降低了Smad3磷酸化水平,抑制了PAI-1mRNA水平的表達。
　　結(jié)論：曲前列素治療肺動脈高壓,改善肺血管重構(gòu)可能與其

23、抑制肺動脈平滑肌細胞TGFβ信號通路,激活BMP信號通路有關(guān)。BMP信號通路可能是PPH治療的重要靶點。
　　第二節(jié)西地那非抑制PASMCs增殖及其對BMP信號通路的調(diào)節(jié)
　　研究背景：BMP信號通路的調(diào)節(jié)是PAH研究關(guān)注的熱點，但至今所知甚少。新近發(fā)現(xiàn)cGMP依賴性蛋白激酶I (cGMP dependent protein kinase I,cGKI)是調(diào)節(jié)BMP信號通路的重要蛋白，cGKI可直接結(jié)合于B MPR-I I，

24、促進受體配體結(jié)合，之后還可以與Smad結(jié)合，促進其磷酸化并一同入核調(diào)節(jié)下游基因表達。cGKI在體內(nèi)主要由環(huán)磷酸鳥普(cyclic guanylic acid，cGMP)激活。NO激活鳥營酸環(huán)化酶(guanylatecyclase，GC)可生成cGMP，其降解則主要通過磷酸二醋酶水解代謝。磷酸二酷酶抑制藥如西地那非(Sildeanfil)己廣泛用于肺動脈高壓治療，其藥理機制在于抑制cGMP的降解而升高其體內(nèi)濃度，達到舒張血管、增加血流的目

25、的。基于新近發(fā)現(xiàn)cGKI是調(diào)節(jié)BMP信號通路的重要蛋白，可直接結(jié)合并調(diào)節(jié)BMP信號通路的各個階段。本節(jié)擬研究西地那非對PASMCs細胞增殖的作用，探討其作用是否與升高cGMP生成，激活cGKI，進而調(diào)節(jié)BMP信號通路有關(guān)。目的在于揭示BMP信號通路在PAH藥物治療中的作用，前瞻性探討 BMP信號通路作為新的PAH藥物治療靶點的可行性。
　　方法：(1)觀察西地那非對人肺動脈平滑肌細胞增殖的影響:人肺動脈平滑肌細胞計數(shù)實驗分為5組(

26、n=3):無血清饑餓對照組:0.1%FBS的DMEM培基;常規(guī)培養(yǎng)對照組:10%FBS的DMEM培基;BMP4處理組:10ng/ml濃度的BMP4;西地那非處理組:1μM濃度西地那非;BMP4合用西地那非處理組:10ng/ml濃度的BMP4合用1μM濃度西地那非。細胞按20000/well密度接種于24孔培養(yǎng)板，分別在處理后第1,4,6天計數(shù)。培基隔天更換。
　　(2)觀察西地那非對人肺動脈平滑肌細胞BMP信號通路的作用:西地那非

27、((1-3 },M)單獨使用或與BMP4合用孵育人肺動脈平滑肌細胞，采用Real-time PCR和Westernblot等技術(shù)檢測細胞BMP信號通路中各蛋白的表達水平。
　　(3)觀察cGMP/cGHI在介導(dǎo)西地那非抑制肺動脈平滑肌細胞增殖、調(diào)節(jié)BMP信號通路中作用:以cGKI抑制劑Rp-8-Br-PET-cGMPs和SiRNA分別抑制、干擾cGKI的表達和功能，觀察cGKI被抑制前后西地那非對PASMCs增殖及BMP信號通路的

28、影響。
　　結(jié)果：1.西地那非抑制PASMCs增殖，合用BMP4可進一步增強BMP4對PASMCs增殖的抑制作用;
　　2.合用西地那非增強BMP4激活的BMP信號下游通路;
　　3.合用cGMP內(nèi)源性擬似物8-br-cGMP增強BMP4激活的BMP信號通路下游通路;
　　4.使用SiRNA干擾沉默cGKI表達后，BMP4合用西地那非增強PASMCs中BMP信號通路的作用減弱;
　　5.使用cGKI抑制物R