RhoA-ROCK信號通路在左心疾病相關(guān)肺動脈高壓肺微血管病變中的作用機(jī)制.pdf

1、目的:通過升主動脈縮窄術(shù)建立大鼠肺動脈高壓模型，探討左心疾病相關(guān)肺動脈高壓形成的病理機(jī)制以及 RhoA/ROCK信號通路在轉(zhuǎn)錄水平的變化及其活性對左心疾病相關(guān)肺高壓肺血管重構(gòu)的影響；探討 RhoA/ROCK信號通路與其它血管活性物質(zhì)（一氧化氮、內(nèi)皮素-1）之間的作用關(guān)系以及ROCK抑制劑法舒地爾對大鼠左心疾病相關(guān)肺動脈高壓肺血管重構(gòu)的作用及其機(jī)制。
　　方法:3-4周齡健康雄性SD大鼠40只，體重90-100g，隨機(jī)分為對照組（C

2、組：n=10）、升主動脈縮窄組（P組：n=10）、升主動脈縮窄后法舒地爾治療組（PF組：n=10）、法舒地爾組（F組：n=10）。P組采用升主動脈固定縮窄術(shù)建立左心疾病相關(guān)大鼠肺動脈高壓模型，C組大鼠行假手術(shù)處理（鈦夾固定于血管旁縱隔組織而非升主動脈，其他所有手術(shù)操作同P組），PF組大鼠術(shù)后一周開始（F組大鼠于 PF組相同時間點(diǎn)），每天給予30mg/Kg法舒地爾腹腔注射，C組、P組在各給藥時間點(diǎn)以等容量生理鹽水為安慰劑進(jìn)行腹腔注射，連續(xù)

3、注射4周，實(shí)驗(yàn)過程中如有大鼠因病重而死亡，則使用相同條件、相同處理的大鼠迅速補(bǔ)位。在建模后60天，對各組大鼠進(jìn)行血流動力學(xué)（右心室收縮壓、平均肺動脈壓力）檢測，于檢測血流動力學(xué)之前，稱量各組大鼠體重并比較；處死大鼠時用PBS行在體心肺灌洗致雙肺變白，左肺組織固定于4％多聚甲醛行病理切片以觀察肺組織病理形態(tài)學(xué)變化，使用Image-Pro Plus6.0對肺小動脈的直徑及管壁進(jìn)行測量，從而計(jì)算小動脈中層增厚的程度（肺小動脈管壁厚度與血管直徑

4、的比值）；取心臟，將右心室（RV）、左心室+室間隔（LV+S）分別稱重，計(jì)算心室肥厚指數(shù)（RV/LV+S）；右肺組織液氮速凍之后于—80℃凍存用于 RT-PCR法檢測基因表達(dá)（ROCK mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA、ET-B受體mRNA）；處死大鼠前采用眼球取血術(shù)每只大鼠保存非抗凝血液5-10ml，留取血清用Elisa試劑盒以檢測NO、ET-1濃度，具體步驟根據(jù)各自試劑盒說明書進(jìn)行。
　　結(jié)果:
　　1

5、.右心室收縮壓、平均肺動脈壓檢測結(jié)果以及各組大鼠體重變化情況:與C組和F組相比，P組大鼠的右心室收縮壓顯著升高（26.02±4.10mmHg、24.35±4.06mmHg升高至56.48±8.93mmHg），平均肺動脈壓亦顯著升高（15.69±2.86mmHg、15.91±1.68mmHg升高至28.98±1.82mmHg），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PF組與 P組相比，右心室收縮壓顯著降低（56.48±8.93mmHg降低至39.03±1.

6、52mmHg），平均肺動脈壓也顯著降低（28.98±1.82mmHg降低至25.25±0.81mmHg），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　檢測血流動力學(xué)之前，各組大鼠稱重比較（造模時重量90-100g），結(jié)果顯示，與 C組和F組相比，P組大鼠的體重明顯降低（461.50±16.50g、454.38±29.88g降低至393.11±63.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PF組與 P組相比，大鼠體重明顯增加（393.11±63.01g升高至443

7、.00±72.75g），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.肺組織病理學(xué)改變以及心室肥厚指數(shù)結(jié)果比較:與C組和F組相比，P組大鼠的肺小動脈中層明顯增厚（即肺小動脈管壁厚度與血管直徑的比值由0.17±0.04、0.06±0.01升高至0.39±0.07），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PF組與P組相比，小動脈中層明顯變?。捶涡用}管壁厚度與血管直徑的比值由0.39±0.07降低至0.19±0.03），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。右心室與左心室+室間隔的濕重之

8、比即為心室肥厚指數(shù)（RV/LV+S），結(jié)果顯示，與 C組和F組相比，P組大鼠的RV/LV+S明顯減低（0.29±0.04、0.29±0.03降低至0.21±0.03），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PF組與P組相比，心室肥厚指數(shù)無明顯差別，而PF組與C組、F組相比，心室肥厚指數(shù)明顯減低(0.29±0.04、0.29±0.03降低至0.24±0.02)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.肺組織ROCK mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mR

9、NA、ET-B受體mRNA表達(dá)的檢測結(jié)果:與C組和F組相比，P組大鼠肺組織的ROCK mRNA、RhoA mRNA、ET-A受體mRNA的相對表達(dá)量均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ET-B受體mRNA的相對表達(dá)量無明顯變化；PF組與P組相比，大鼠肺組織的ROCK mRNA、ET-A受體mRNA的相對表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RhoA mRNA、ET-B受體mRNA的相對表達(dá)量無明顯變化。
　　4.血清中NO、ET-1濃度

10、的檢測結(jié)果:與C組和F組相比，P組大鼠血清NO的濃度明顯降低（73.58±12.31μM、57.13±8.04μM降低至38.68±2.80μM），而血清ET-1的濃度明顯增高（0.63±0.18pg/ml、0.66±0.22pg/ml升高至2.83±0.25pg/ml），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PF組與P組相比，大鼠血清NO的濃度明顯增高（38.68±2.80μM升高至105.22±11.04μM）,而血清 ET-1的濃度明顯降低（2.8