攜帶IL-15的T細(xì)胞對(duì)肝癌細(xì)胞的體外殺傷研究.pdf

1、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor-infiltrating lymphocyte,TIL)是脫離血流后遷移至腫瘤組織的白細(xì)胞,主要由T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞組成。TIL對(duì)黑素瘤的過繼治療取得了很好的效果,而對(duì)肝癌的療效并不理想,這可能與肝癌內(nèi)TIL相對(duì)少見以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制有關(guān)。TIL的分離和擴(kuò)增方法以及快速擴(kuò)增(rapid expansion procedure,REP)所需的大量IL-2和飼養(yǎng)細(xì)胞限制了這種過繼治療在世界范圍內(nèi)的

2、推廣。
　　 IL-15具有刺激T細(xì)胞增殖,調(diào)節(jié)B細(xì)胞增殖和分化,提高NK細(xì)胞的殺傷活性并維持其存活,誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的產(chǎn)生和殺傷活性,抑制活化T細(xì)胞的凋亡等功能。另外,IL-15可通過活化磷脂酰肌醇-3-激酶途徑使淋巴細(xì)胞能抵抗調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制作用。
　　 本研究利用攜帶IL-15基因的嵌合型腺病毒-腺相關(guān)病毒雜合載體Ad5/35.AAV-hIL-15轉(zhuǎn)染TIL表達(dá)IL-15。5/35嵌合型腺病毒可以有效轉(zhuǎn)染T細(xì)胞

3、和NK細(xì)胞,AAV反向末端重復(fù)序列(inverted terminal repeat,ITR)的引入可以使目的基因在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá),突變胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因的表達(dá)可以使細(xì)胞在加入丙氧烏苷(gancyclovir,GCV)后發(fā)揮自殺功能。
　　 本研究用組織塊培養(yǎng)獲得了“年輕”TIL,并對(duì)TIL REP中抗CD3單克隆抗體(OKT3)、IL-2及飼養(yǎng)細(xì)胞的用量進(jìn)行了試驗(yàn)性摸索,發(fā)現(xiàn)OKT3用量

4、增加并不會(huì)顯著提高TIL的擴(kuò)增倍數(shù),而采用3000 IU/ml IL-2或50倍于TIL的飼養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)分別與6000 IU/ml和200倍的相當(dāng)。最終,選擇30 ng/ml OKT3、3000 IU/ml IL-2和50倍的飼養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行TIL,REP,擴(kuò)增達(dá)4000倍以上。若用于REP的TIL細(xì)胞數(shù)不少于5×107,那么理論上擴(kuò)增后TIL可達(dá)到2×1011以上。
　　 對(duì)含尼IL-15基因的質(zhì)粒進(jìn)行PCR,得到的目的基因產(chǎn)

5、物與質(zhì)粒pDC759-TV1經(jīng)EcoRI和BamHI酶切后連接,成功構(gòu)建了質(zhì)粒pDC759-hIL-15。質(zhì)粒鑒定正確后與含35型腺病毒纖毛的腺病毒骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞,同源重組產(chǎn)生雜合病毒Ad5/35.AAV-hIL-15。該病毒充分結(jié)合了腺病毒和AAV的優(yōu)勢(shì),能有效轉(zhuǎn)染T細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá)IL-15。
　　 采用CopGFP報(bào)告基因證實(shí)了載體Ad5/35.AAV對(duì)TIL的轉(zhuǎn)染效率明顯高于Ad5.AAV。ELISA檢測(cè)到病毒A

6、d5/35.AAV-hIL-15轉(zhuǎn)染的TIL有目的蛋白IL-15的表達(dá)。MOI=1、10時(shí)病毒Ad5/35.AAV-hIL-15可促進(jìn)TIL增殖,MOI=100時(shí)則對(duì)增殖不利。加入GCV后,觀察病毒Ad5/35.AAV-TK-CopGFP轉(zhuǎn)染的SMMC-7721的綠色熒光及細(xì)胞形態(tài),MTT法檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染后TIL的增殖情況,最終確認(rèn)了病毒轉(zhuǎn)染后突變TK的表達(dá)及其自殺功能。MOI=1、10時(shí)病毒Ad5/35.AAV-hIL-15轉(zhuǎn)染的。TI