2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、目的:人呼吸道合胞病毒(Human Respiratory Syncytial Virus,RSV)廣泛流行于世界各地,是嬰幼兒下呼吸道感染的最重要病原。目前尚無安全、有效的疫苗用于預防RSV感染。RSV兩個重要的糖蛋白膜表面表達的融合蛋白F(fusion protein,F(xiàn))和粘附蛋白G,是激發(fā)機體產(chǎn)生中和抗體的主要蛋白,也是疫苗研究發(fā)展的重要內容。與G蛋白相比,F(xiàn)蛋白有更多的抗原識別位點,不同亞型間F蛋白高度保守、同源性高達86%,

2、能刺激機體產(chǎn)生體液免疫及細胞免疫應答,針對F的中和抗體具有交叉保護作用,是RSV疫苗研究的最重要的靶抗原。輔助病毒依賴型腺病毒載體(helper-dependent adenoviral vector,HDAd)主要用于基因治療研究,作為疫苗載體的研究起步較晚,尚沒有作為黏膜基因釋放系統(tǒng)用于疫苗研究的報道。HDAd與腺病毒具有相同的細胞嗜性,對呼吸道上皮細胞具有高效感染的能力,且能長期、持續(xù)表達轉基因,具有重要的研究與使用價值。本研究擬

3、構建可表達A亞型RSv F蛋白的輔助病毒依賴型腺病毒載體(HDAd/F),并完成大量制備、純化和F蛋白的體外表達鑒定,為進一步的體內免疫效果和免疫保護作用研究奠定基礎。 方法:將帶有CMV啟動子序列的F基因亞克隆至克隆載體pSC11,鑒定正確后,克隆至HDAd質粒-pSC15B,構建pSC15B/F HDAd重組質粒,Pme Ⅰ消化pSC15B/F去除原核復制元件及抗性基因,獲得 HDAd/F DNA分子,經(jīng)磷酸鈣共沉淀法轉染2

4、93Cre4細胞,16 h后感染輔助病毒,收獲 HDAd/F 載體粗提液,隨后以 HDAd/F粗提液及輔助病毒連續(xù)共感染293Cre4細胞直至HDAd/F達到復制極限,同時以可表達β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ)報告基因的HDAdLacZ載體作為平行對照監(jiān)測載體復制過程。大量制備 HDAd/F,CsCl密度梯度及等密度梯度兩次超速離心純化,利用分子生物學技術體外鑒定HDAd/F表達情況。 結果:成功構建

5、了可表達 RSV F 蛋白的 HDAd/F 載體,通過與輔助病毒共感染293Cre4細胞及CsCl梯度法超速離心制備了大量純化的HDAd/F載體,透射電鏡觀察顯示HDAd的直徑約為70 nm,具有典型的腺病毒形態(tài),運用分光光度測定法分析表明純化后HDAd載體顆粒濃度為:7.4×10<'12>(vp/ml),體外感染293細胞,RT-PCR檢測到F基因有轉錄,Western blot分析表明F蛋白有特異性表達。 結論:成功構建HD

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