蟾毒靈抑制人肝癌細(xì)胞MHCC97H轉(zhuǎn)移的實驗研究.pdf

1、研究背景：
　　 肝細(xì)胞肝癌占原發(fā)性肝癌的85％-90％，在我國是一種常見的腫瘤類型，其發(fā)病和慢性乙型肝炎密切相關(guān)。盡管近年來在預(yù)防和治療策略上取得了一定的進(jìn)展，其死亡率仍然居高不下。由于比較高的手術(shù)后肝內(nèi)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生率，肝癌的預(yù)后還是比較差。因此，闡明肝癌侵襲及轉(zhuǎn)移的具體分子機制，變得越來越重要。
　　 肝癌的轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，每一環(huán)節(jié)都有多種因素的影響和調(diào)控，例如細(xì)胞外蛋白酶、細(xì)胞因子、血管生成因子、生長

2、因子、細(xì)胞黏附分子等。其中，Cdc42是Rho家族蛋白，是Ras超家族中相對小分子質(zhì)量G蛋白的成員之一，有GTP酶活性。研究證實Cdc42是細(xì)胞骨架肌動蛋白的重要調(diào)節(jié)因子，而肌動蛋白的運動是腫瘤細(xì)胞偽足形成及腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，Cdc42在非活性GDP結(jié)合形式和活性GTP結(jié)合形式之間循環(huán)，與GDP結(jié)合形式游離于胞質(zhì)中，與GTP結(jié)合形式則作用于細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)因子，與肝癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。
　　 蟾毒靈(bufalin)的分子式為C24

3、H34O4，相對分子質(zhì)量為386.5，是從傳統(tǒng)中藥蟾酥中提取的一種毒性配基之一，已有研究表明蟾毒靈是一種Na+-K+-ATP酶抑制劑，屬于蟾酥二烯羥酸內(nèi)酯單體之一，因其分子結(jié)構(gòu)與洋地黃類似，也被歸為強心類固醇類。文獻(xiàn)報道其能夠抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的活性，干擾細(xì)胞DNA復(fù)制，早期多數(shù)研究集中在誘導(dǎo)人類白血病分化和凋亡方面，近年來有研究表明蟾毒靈可以抑制子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞以及卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤細(xì)胞的生長。
　　 在本研究中，我們利

4、用高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞系，通過體外及體內(nèi)實驗，來探索蟾毒靈對肝癌轉(zhuǎn)移的抑制作用和Cdc42蛋白之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)Cdc42是蟾毒靈作用的靶點之一，在肝癌細(xì)胞運動和轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用，蟾毒靈可能是通過下調(diào)Cdc42來抑制肝癌轉(zhuǎn)移。
　　 研究目的：
　　 本研究觀察蟾毒靈對肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步通過體外、體內(nèi)實驗明確其抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的具體機制，明確蟾毒靈抑制侵襲轉(zhuǎn)移作用和Cdc42信號通路之間的關(guān)系，為尋找

5、有效的抗肝癌轉(zhuǎn)移藥物和治療靶點提供實驗依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 (1)不同濃度蟾毒靈抑制肝癌細(xì)胞運動的效應(yīng)
　　 以不同濃度(50-400nmol/L)的蟾毒靈干預(yù)MHCC97H細(xì)胞，采用劃痕實驗定性研究蟾毒靈對肝癌細(xì)胞遷移的影響；在此基礎(chǔ)之上，利用Transwell小室，包被基質(zhì)膠，體外模擬基底膜，進(jìn)行侵襲和遷移實驗，定量觀察蟾毒靈對肝癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響。
　　 (2)蟾毒靈對肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)信號

6、通路及Cdc42蛋白的影響
　　 首先，觀察不同肝癌細(xì)胞系中Cdc42的表達(dá)情況，westernblot檢測蟾毒靈對Cdc42蛋白表達(dá)的影響，構(gòu)建Cdc42siRNA，觀察Cdc42基因RNA干擾后對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響；觀察蟾毒靈對MAPK信號通路的影響，分別使用ERK、JNK、P38抑制劑后觀察蟾毒靈對肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響；westernblot檢測蟾毒靈對P53基因表達(dá)及下游靶分子Bax、P27的影響；分別提取胞漿胞核

7、蛋白，觀察NF-κBp65蛋白入核的變化；westernblot檢測蟾毒靈對COX-2蛋白表達(dá)的影響；ELISA方法檢測MMPs家族MMP-2、MMP-3、MMP-9水平變化。
　　 (3)蟾毒靈體內(nèi)抑制MHCC97H肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的實驗研究
　　 原位植入建立裸鼠人肝癌轉(zhuǎn)移模型LCI-D20,蟾毒靈干預(yù)后(低劑量組：0.25mg·kg-1d-1；高劑量組：0.5mg·kg-1d-1)，通過評價原位瘤的體積、重量來評價蟾毒

8、靈的抑瘤作用，通過對裸鼠體重的評價來研究蟾毒靈對裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移模型惡病質(zhì)的影響；肝臟原位移植瘤塊，常規(guī)石蠟包埋病理切片并用免疫組織化學(xué)法觀察肝原位移植瘤中Cdc42蛋白的表達(dá)情況；肺臟標(biāo)本經(jīng)10％中性福爾馬林固定、石蠟包埋、切片、HE染色，于不同平面切片20～30張，以觀察肺轉(zhuǎn)移情況。
　　 結(jié)果：
　　 (1)蟾毒靈抑制肝癌細(xì)胞運動實驗研究
　　 劃痕實驗結(jié)果顯示，蟾毒靈干預(yù)組劃痕損傷區(qū)發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)目少于空白

9、對照組，提示蟾毒靈具有抑制MHCC97H細(xì)胞遷移的趨勢，Transwell小室侵襲及遷移實驗結(jié)果顯示蟾毒靈干預(yù)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，50nmol/L蟾毒靈即能有效抑制肝癌細(xì)胞侵襲和遷移。
　　 (2)蟾毒靈對Cdc42蛋白及肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)信號通路的影響
　　 Westernblot結(jié)果顯示Cdc42蛋白在MHCC97H細(xì)胞中高表達(dá)，蟾毒靈(200nmol/L)處理后2h內(nèi)Cdc42蛋

10、白表達(dá)明顯下調(diào)，Cdc42siRNA干擾后，能夠增強蟾毒靈抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H侵襲的作用，和蟾毒靈發(fā)揮協(xié)同的作用；蟾毒靈對MAPK家族的影響包括抑制ERK信號通路，活化JNK、P38信號通路，ERK通路抑制劑(PD98059)，能夠增強蟾毒靈抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H侵襲的作用，而JNK抑制劑(SP-600125)、P38抑制劑(SB203580)能夠部分逆轉(zhuǎn)蟾毒靈抑制肝癌細(xì)胞MHCC97H侵襲的作用；蟾毒靈能夠使P53基因及下游

11、靶分子Bax、P27表達(dá)上調(diào)；蟾毒靈能夠抑制NF-κBp65蛋白入核；蟾毒靈能夠抑制COX-2蛋白表達(dá)；ELISA結(jié)果顯示蟾毒靈能夠減少MMP-2的分泌，而對MMP-3、MMP-9的分泌未見明顯影響；
　　 (3)蟾毒靈體內(nèi)抑制MHCC97H肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的實驗研究
　　 與對照組比較，蟾毒靈干預(yù)組裸鼠外觀上消瘦較對照組有所改善，精神狀態(tài)、活動能力也較對照組好；蟾毒靈干預(yù)的裸鼠腫瘤重量、體積明顯減小，與DMSO對照組相比，

12、差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05)，提示了蟾毒靈對原位移植肝細(xì)胞癌腫瘤的生長具有明顯的抑制作用。蟾毒靈處理組瘤塊切面多呈黃白色豆渣樣，病理證實為較多壞死：蟾毒靈處理組肺轉(zhuǎn)移率明顯低于對照組(P<0.05)；Cdc42在蟾毒靈處理組中的陽性率低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示在體內(nèi)Cdc42和肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移相關(guān)，并可被蟾毒靈抑制。
　　 結(jié)論：
　　 1.蟾毒靈可抑制高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞(MHCC97H)侵襲、

13、遷移運動。
　　 2.蟾毒靈可以抑制Cdc42表達(dá)，其抑制高轉(zhuǎn)移潛能的肝癌細(xì)胞侵襲、遷移運動和抑制Cdc42密切相關(guān)。
　　 3.蟾毒靈可能通過活化JNK、P38MAPK，抑制ERK通路發(fā)揮抑制MHCC97H細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。
　　 4.蟾毒靈能夠上調(diào)P53及其下游靶分子Bax和P27表達(dá)。
　　 5.蟾毒靈能抑制MMP-2、COX-2表達(dá)，而對MMP-3、MMP-9表達(dá)未見明顯影響，提示我們蟾毒靈抑制