山藥致癢活性成分的分離純化及其與Mrgprs家族相關(guān)性研究.pdf

1、山藥性味甘平，具有廣泛的生理藥效活性，常用于各種方劑及日常食療保健。直接接觸新鮮山藥可以導(dǎo)致癢的發(fā)生，山藥致癢的機(jī)理尚無(wú)研究報(bào)道。
　　癢(itch)是一種不愉快的感覺(jué)，它可以引起搔抓欲望或者搔抓反射。癢常見(jiàn)于各種皮膚病，及一些系統(tǒng)性疾病。瘙癢嚴(yán)重影響人類(lèi)日常生活，但目前針對(duì)各種瘙癢的臨床治療相對(duì)困難，除了常規(guī)的抗組胺治療外，尚無(wú)更有效的治療方法。
　　目前知道的致癢物質(zhì)主要分為兩類(lèi):一類(lèi)是組胺類(lèi)的致癢物質(zhì)，包括組胺和可以刺

2、激肥大細(xì)胞產(chǎn)生組胺的物質(zhì)，其受體主要是組胺受體;另外一類(lèi)是非組胺類(lèi)的致癢物質(zhì):如氯喹、小肽BAM8-22，SLIGRL肽，菠蘿蛋白酶、黑藜豆蛋白等，其受體主要是Mrgprs家族蛋白及PAR-2受體。直接接觸新鮮山藥汁引起的癢，并不會(huì)出現(xiàn)組胺致癢時(shí)的紅腫瘢痕，因此推測(cè)其致癢物質(zhì)是屬于非組胺類(lèi)致癢物質(zhì)。Mrgprs能夠被非組胺類(lèi)的致癢物質(zhì)如氯喹、小肽BAM8-22、SLIGRL、β-丙氨酸激活，導(dǎo)致癢覺(jué)的產(chǎn)生;一些瘙癢疾病如慢性瘙癢、接觸性

3、皮炎等也與Mrgprs關(guān)系密切。因此，Mrgprs在非組胺依賴(lài)的癢覺(jué)中可能扮演重要的角色。
　　第一部分理論研究
　　該部分對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了整理及概括，較系統(tǒng)的綜述了山藥各種成分的分離純化及藥理藥效研究，對(duì)癢的中西醫(yī)研究情況進(jìn)行了概述，并主要介紹了Mrgprs家族與癢的相關(guān)性。
　　第二部分山藥致癢活性成分的提取與Mrgprs家族相關(guān)性研究
　　動(dòng)物行為學(xué)研究表明，新鮮山藥汁皮下注射可以引起野生型小鼠的抓撓反應(yīng)，

4、而皮下注射給予生理鹽水、土豆勻漿，小鼠抓撓反應(yīng)顯著降低(P＜0.05)，而加熱煮沸對(duì)山藥致癢活性無(wú)影響，以上結(jié)果表明山藥致癢引起的抓撓反應(yīng)與溶劑、大分子淀粉顆粒、及大分子蛋白質(zhì)無(wú)關(guān)。而在Mrgpr-cluster△-/-小鼠中，與同窩WT小鼠相比，新鮮山藥汁引起的抓撓反應(yīng)顯著降低(P＜0.05)，表明山藥致癢與Mrgprs家族相關(guān)。
　　采用乙醇浸提法提取的山藥致癢活性部位可以有效獲得其活性致癢成分，行為學(xué)研究表明給予山藥乙醇浸膏

5、明顯引起小鼠抓撓反應(yīng)。將獲得的乙醇浸膏經(jīng)過(guò)氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分步萃取，通過(guò)動(dòng)物行為學(xué)考察山藥致癢的活性部位，發(fā)現(xiàn)乙醇提取后沉淀部分不能引起動(dòng)物癢覺(jué)，推測(cè)可能不是多糖物質(zhì)起作用，而萃取得到的氯仿相、乙酸乙酯相也沒(méi)有表現(xiàn)出較好的致癢活性，隨著萃取溶劑極性進(jìn)一步加大，極性較高的正丁醇萃取相表現(xiàn)出了一定致癢活性，但山藥致癢活性仍然以萃取殘余水層致癢活性最高。以上結(jié)果表明山藥致癢，引起動(dòng)物抓撓反應(yīng)可能是一類(lèi)水溶性的、極性較高的化合物在起作用。

6、
　　第三部分山藥致癢活性成分的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定
　　采用(A)KTA purifier全自動(dòng)液相色譜系統(tǒng)，以Sephadex-G50凝膠柱分離純化山藥乙醇浸膏，獲得峰1（fraction-1）和峰2（fraction-2）。采用(A)KTA purifier全自動(dòng)液相色譜系統(tǒng)，以Mono Q5/50陰離子交換柱分離fraction-1，獲得峰型單一對(duì)稱(chēng)的峰Ⅰ（fraction-Ⅰ）、峰Ⅱ（fraction-Ⅱ）和峰Ⅲ（f

7、raction-Ⅲ）。采用Waters-2695-2996全自動(dòng)高效液相色譜系統(tǒng)，以Thermo Hypersil BDS C18色譜柱分離峰Ⅰ（fraction-Ⅰ），洗脫體系為甲醇-水(各相均含0.1％ TFA)，獲得峰型單一對(duì)稱(chēng)的峰Ⅰ-1（fraction-Ⅰ-1）、峰Ⅰ-2（fraction-Ⅰ-2）和峰Ⅰ-3（fraction-Ⅰ-3）。采用懸滴法進(jìn)一步分離純化fraction-Ⅰ-2，獲得純度較高的化合物晶體。
　　采

8、用Agilent公司SuperNova雙波長(zhǎng)單晶衍射儀，獲得晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，進(jìn)行解析，確定該晶體為單斜晶系，分子量為158.13，分子式為C4H6N4O3，暫命名為NJUTCM-01。
　　以上結(jié)果表明，采用葡聚糖凝膠色譜法、離子交換色譜法、HPLC色譜法、結(jié)晶法可以有效的分離純化山藥中致癢活性成分，所獲得的晶體純度較高，采用單晶衍射可以獲得山藥中致癢活性成分的晶體學(xué)參數(shù)，分子量為158.13，分子式為C4H6N4O3，根據(jù)文獻(xiàn)暫命

9、名為NJUTCM-01。
　　第四部分山藥致癢活性成分的活性鑒定及其致癢分子機(jī)制的初步研究
　　將葡聚糖凝膠Sephadex-G50柱分離純化出的fraction-1和fraction-2進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，葡聚糖凝膠分離獲得的fraction-1與fraction-2可以引起動(dòng)物抓撓反應(yīng)(P＜0.05)，fraction-1內(nèi)可以引起顯著的抓撓反應(yīng)顯著高于同等劑量的fraction-2(P＜0.

10、05)。
　　將離子交換分離fraction-1獲得的fraction-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ，采用原代細(xì)胞培養(yǎng)方法獲得WT小鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞，以Fura-2孵育40min后，應(yīng)用鈣成像的方法考察致癢物質(zhì)的細(xì)胞活性，通過(guò)觀察細(xì)胞亮度及細(xì)胞反應(yīng)數(shù)目來(lái)確定反應(yīng)活性。結(jié)果表明，fraction-Ⅰ活性最高，其次是fraction-Ⅲ，而fraction-Ⅱ幾乎無(wú)活性。將C18反相柱分離fraction-Ⅰ獲得的fraction-Ⅰ-1、fra

11、ction-Ⅰ-2及fraction-Ⅰ-3，應(yīng)用鈣成像的方法考察致癢物質(zhì)的細(xì)胞活性，通過(guò)觀察細(xì)胞亮度及細(xì)胞反應(yīng)數(shù)目來(lái)確定反應(yīng)活性，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明fraction-Ⅰ-2活性最高，而fraction-Ⅰ-1及fraction-Ⅰ-3活性很弱或無(wú)活性。以結(jié)晶法分離純化fraction-Ⅰ-2，采用鈣成像的方法考察致癢物質(zhì)的細(xì)胞活性，通過(guò)觀察細(xì)胞亮度及細(xì)胞內(nèi)鈣離子隨時(shí)間變化圖確定反應(yīng)活性，結(jié)果表明，給予晶體后，在短時(shí)間內(nèi)即可引起DRG神經(jīng)元細(xì)

12、胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流達(dá)到峰值反應(yīng)強(qiáng)度。
　　將分離純化確定結(jié)構(gòu)的NJUTCM-01給予小鼠背部皮下注射，動(dòng)物行為學(xué)結(jié)果顯示，與溶劑對(duì)照組相比，NJUTCM-01可以引起動(dòng)物抓撓反應(yīng);而給予WT小鼠及Mrgpr-cluster△-/-小鼠背部皮下注射。動(dòng)物行為學(xué)結(jié)果顯示，與WT組相比，Mrgpr-cluster△-/-小鼠中NJUTCM-01引起動(dòng)物抓撓反應(yīng)顯著降低。
　　根據(jù)之前預(yù)實(shí)驗(yàn)，原代培養(yǎng)獲得WT小鼠的DRG神經(jīng)元細(xì)胞，F(xiàn)u

13、ra-2孵育40min后，將NJUTCM-01給藥用于鈣成像實(shí)驗(yàn)。觀察細(xì)胞亮度變化、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度隨時(shí)間變化圖，并統(tǒng)計(jì)對(duì)NJUTCM-01刺激反應(yīng)的細(xì)胞比例，結(jié)果表明，灌流給予NJUTCM-01后，在短時(shí)間內(nèi)即可引起DRG神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流達(dá)到峰值反應(yīng)強(qiáng)度，并隨著灌流液持續(xù)灌流呈洗脫的趨勢(shì);通過(guò)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞反應(yīng)比例發(fā)現(xiàn)，有8％的DRG神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)NJUTCM-01有響應(yīng)(n=458)。同樣，電生理實(shí)驗(yàn)表明，膜片鉗記錄到的響應(yīng)NJUTC

14、M-01刺激的細(xì)胞屬于小直徑的感覺(jué)細(xì)胞神經(jīng)元。
　　原代培養(yǎng)獲得WT、Gcamp小鼠的DRG神經(jīng)元細(xì)胞，將NJUTCM-01、氯喹、組胺、薄荷醇、辣椒素采用灌流方式給藥用于鈣成像實(shí)驗(yàn)。觀察細(xì)胞亮度變化、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度隨時(shí)間變化圖，并統(tǒng)計(jì)上述藥物刺激反應(yīng)的細(xì)胞比例。結(jié)果表明，在給予Mrgpr A3與組胺受體各自的激動(dòng)劑氯喹和組胺引起反應(yīng)的部分細(xì)胞，同時(shí)也可以被NJUTCM-01激活。此外，對(duì)薄荷醇刺激有反應(yīng)的神經(jīng)元細(xì)胞中有24.5

15、％也對(duì)NJUTCM-01有反應(yīng);而92％對(duì)NJUTCM-01刺激有反應(yīng)的神經(jīng)元也對(duì)辣椒素也有反應(yīng)。
　　第五部分結(jié)論
　　(1)動(dòng)物行為學(xué)研究表明，新鮮山藥汁皮下注射可以引起野生型小鼠的抓撓反應(yīng)，且與溶劑、大分子淀粉顆粒、及大分子蛋白質(zhì)無(wú)關(guān)。
　　(2)山藥致癢與Mrgprs家族有關(guān)。
　　(3)采用乙醇浸提法及溶劑萃取法可以有效獲得山藥活性致癢成分，山藥致癢的活性成分可能是一類(lèi)水溶性的、極性較高的化合物。

16、>　　(4)利用葡聚糖凝膠色譜法分離純化山藥乙醇提取浸膏，獲得fraction-1和fraction-2;利用陰離子交換色譜法分離純化離子交換獲得的fraction-1，獲得fraction-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ;利用HPLC反相色譜法分離純化陰離子交換獲得的fraction-Ⅰ，獲得fraction-Ⅰ-1、fraction-Ⅰ-2和fraction-Ⅰ-3;利用懸滴法對(duì)fraction-Ⅰ-2進(jìn)行結(jié)晶純化，獲得純度較高的化合物晶體;利用X

17、-射線單晶衍射儀對(duì)該化合物的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)進(jìn)行收集，確定分子量為158.13，分子式為C4H6N4O3，根據(jù)文獻(xiàn)暫命名為NJUTCM-01。
　　(5)采用葡聚糖凝膠、陰離子交換、HPLC-C18及懸滴法結(jié)晶分離山藥乙醇提取物分別獲得致癢成份，通過(guò)動(dòng)物行為學(xué)及鈣成像研究考察其活性，表明這些化合物都有較好的致癢活性。
　　(6)山藥中所含有的NJUTCM-01的確可以致癢，是山藥致癢的主要因素，且與Mrgprs家族相關(guān)。