LAL和STAT3的活化對小鼠肺穩(wěn)態(tài)性影響的研究.pdf

1、第一部分 溶酶體酸性脂肪酶對小鼠肺板層小體形成及肺穩(wěn)態(tài)性影響
　　肺主要包括通氣和換氣兩大功能,氣體是通過肺泡和血液把氧氣和二氧化碳進行交換從而完成。肺泡壁表面被覆肺泡Ⅰ型細(xì)胞和Ⅱ型細(xì)胞。肺泡Ⅱ型細(xì)胞中的板層小體是由管狀髓磷脂構(gòu)成的囊狀結(jié)構(gòu),主要成分包括脂蛋白和溶酶體酶,它是作為分泌和儲存肺泡表面活性物質(zhì)的場所。板層小體通過胞吐作用釋放表面活性物質(zhì)于肺泡內(nèi)表面,降低肺泡表面張力,維持肺泡大小,防止肺泡壁塌陷。肺泡表面活性物質(zhì)主要成

2、分為90％-95%的脂質(zhì)和5%-10%的表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白,80%的脂質(zhì)是磷脂,另有約10%左右的脂質(zhì)由中性脂構(gòu)成。膽固醇酯(Cholesteryl ester,CE)和甘油三酯(Triglycerides,TG)是中性脂的重要組成部分。溶酶體酸性脂肪酶(Lysosomal acid lipase,LAL)是膽固醇酯和甘油三酯等中性脂在細(xì)胞內(nèi)代謝所必需的水解酶。有關(guān)表面活性物質(zhì)中表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白和磷脂在降低肺表面張力,維持肺的順應(yīng)

3、性以及機體防御等方面作用的研究較多,但關(guān)于中性脂的作用國內(nèi)外的研究報道很少。
　　為了進一步研究中性脂代謝在肺組織中的作用,我們首次構(gòu)建了強力霉素(Doxycycline,DOX)誘導(dǎo)調(diào)控的hLAL過表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞的CCSP-rtTA/(tetO)7-hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,此雙轉(zhuǎn)基因小鼠調(diào)節(jié)基因CCSP-rtTA帶有大鼠2.3kbCCSP基因啟動子調(diào)控下的rtTA融合蛋白基因,目的基因TetO-CMV-hLAL帶有7個拷貝

4、的TetO和部分CMV啟動子組成的四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)調(diào)控下的hLAL。由于rtTA特異性表達(dá)于肺泡Ⅱ型細(xì)胞,食物中加入DOX,使目的基因hLAL轉(zhuǎn)錄激活并特異性表達(dá)于肺泡Ⅱ型細(xì)胞。
　　RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示,DOX處理CCSP-rtTA/(tetO)7-hLAL轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織內(nèi)可誘導(dǎo)hLAL mRNA及蛋白的表達(dá),并且hLAL過表達(dá)加速中性脂(包括膽固醇酯和甘油三酯)的降解,降低了肺泡灌洗液中性脂

5、的濃度。為了進一步了解中性脂的減少對肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)板層小體的影響。分別提取DOX食物處理6個月及未處理hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織作電鏡切片。結(jié)果顯示DOX處理組hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)板層小體數(shù)量及表面積明顯減少。未經(jīng)DOX處理組小鼠肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)板層小體無明顯異常。
　　肺泡表面活性物質(zhì)中除了脂質(zhì)成分外,肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白對板層小體的形成及表面活性物質(zhì)的穩(wěn)定性也發(fā)揮一定的作用。為了了解hLAL基因過表達(dá)對肺泡表面

6、活性相關(guān)蛋白的影響,采用RT-PCR及Western Blot方法檢測DOX處理組及未處理組的hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A,B,C(SP-A,SP-B,SP-C)及CCSP的mRNA、蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果證實DOX處理組hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中SP-C基因mRNA及蛋白水平明顯降低,而SP-A,SP-B及CCSP基因表達(dá)水平無明顯變化。
　　肺泡巨噬細(xì)胞參與肺泡表面活性物質(zhì)的清除及再利用,從而在維持肺穩(wěn)態(tài)中

7、發(fā)揮著一定的作用。由于肺組織內(nèi)中性脂減少,因此推測參與表面活性物質(zhì)清除及再利用的肺泡巨噬細(xì)胞可能也相應(yīng)減少。于是測定了hLAL轉(zhuǎn)基因小鼠肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞的數(shù)量。結(jié)果顯示,處理組4個月及8個月小鼠肺泡灌洗液中巨噬細(xì)胞比未處理組明顯減少,肺組織中出現(xiàn)區(qū)域性肺不張及區(qū)域性肺氣腫等形態(tài)學(xué)改變。因此,認(rèn)為中性脂在維持肺泡的組織結(jié)構(gòu)及肺穩(wěn)態(tài)性中發(fā)揮著一定的作用。
　　小結(jié):
　　本實驗表明:(1)hLAL基因過表達(dá)降低了肺內(nèi)膽固醇酯

8、和甘油三酯的濃度,肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)板層小體的數(shù)目減少。(2)hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中SP-C基因mRNA及蛋白水平明顯降低,而SP-A,SP-B及CCSP基因表達(dá)水平無明顯變化。(3)DOX處理組hLAL雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺泡灌洗液中的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減少,肺組織出現(xiàn)區(qū)域性肺不張及區(qū)域性肺氣腫等形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)論:
　　中性脂對肺泡Ⅱ型細(xì)胞板層小體形成、維持肺泡的組織結(jié)構(gòu)及肺的穩(wěn)態(tài)性發(fā)揮著一定的作用。
　　第二部分 S

9、TAT3信號途徑活化誘發(fā)肺部炎癥反應(yīng)及肺癌形成
　　信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(Signal transduction and activators of transcription family3,STAT3)作為轉(zhuǎn)錄因子在信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化過程中發(fā)揮重要作用。IL-6家族細(xì)胞因子通過與其受體IL-6R結(jié)合激活細(xì)胞內(nèi)JAKs,JAK激酶磷酸化STAT3705位酪氨酸位點(Y705),形成同/異源二聚體,并移位至核內(nèi),啟動靶基因的轉(zhuǎn)

10、錄,從而將短暫的胞漿信號轉(zhuǎn)化為長期的基因表達(dá)。JAK-STAT信號傳導(dǎo)途徑具有抑制細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞增殖的作用,廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、免疫反應(yīng)以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定相關(guān)的生命活動。但是,迄今為止始終沒有一個動物模型證實STAT3信號途徑的活化可以直接導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。
　　利用STAT3C分子能模擬STAT3形成二聚體才能核轉(zhuǎn)位的生理特性,采用Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng),建立CCSP-rtTA?(tetO)7-CMV-STAT3C雙轉(zhuǎn)基因小鼠

11、模型,在強力霉素(Doxycycline, DOX)的調(diào)控下,STAT3于特定時間、特異的在肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)。經(jīng)DOX食物喂養(yǎng)后,CCSP啟動子可調(diào)控目的基因STAT3C基因在肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞過表達(dá)。DOX處理9個月的CCSP/STAT3C小鼠肺組織內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)并導(dǎo)致肺腺癌的發(fā)生。采用流式細(xì)胞儀、基因芯片、Real-Time PCR及免疫組織化學(xué)的方法檢測STAT3C過表達(dá)引起的肺內(nèi)微環(huán)境的變化。發(fā)現(xiàn)STAT3C雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中出

12、現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤,基因芯片篩選分析結(jié)果顯示肺癌形成時期肺組織中許多細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)升高,Real-Time PCR證實在DOX處理早期肺泡Ⅱ型細(xì)胞多種細(xì)胞因子、趨化因子表達(dá)增高?；蛐酒治鲞€發(fā)現(xiàn)TTF-1、SHH等肺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)亦明顯增高,這些基因表達(dá)將促進肺泡上皮細(xì)胞增生。因此,認(rèn)為STAT3C誘發(fā)肺癌的過程可能通過兩個階段完成,第一個階段異常表達(dá)的細(xì)胞因子/趨化因子誘發(fā)肺組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤,干擾免疫監(jiān)視從而促進了腫瘤發(fā)

13、生發(fā)展。第二個階段肺發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的再激活促進了肺上皮細(xì)胞增殖。
　　小結(jié):
　　本實驗表明(1)CCSP-rtTA(tetO)7-CMV-STAT3C雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,在DOX誘導(dǎo)調(diào)控下,STAT3特異性表達(dá)于肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞,DOX處理9個月的STAT3C雙轉(zhuǎn)基因小鼠中肺組織中大量炎癥細(xì)胞浸潤、肺腺癌的形成。(2)基因芯片篩選分析結(jié)果顯示DOX處理STAT3C雙轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中大量細(xì)胞因子、趨化因子及肺發(fā)育相關(guān)基因(