SB203580在LPS誘導(dǎo)MH-S細(xì)胞STAT3活化的作用.pdf

1、目的：炎癥性肺病(inflammatory lung disease，ILD)是感染、中毒、免疫等各種肺內(nèi)外因素引起的肺部炎癥反應(yīng)。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是其重要致病因素。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophage，AM)作為肺部第一道防線，在啟動和維持炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要作用。LPS作用于AM表面受體，通過細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)傳遞，可釋放促炎因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis fact

2、or，TNF)-α和抗炎因子如白介素(Interleukin，IL)-10。P38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase，MAPK)是參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的重要激酶，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活子-3(signal transducers and activators of transcription-3，STAT3)在LPS導(dǎo)致的炎癥瀑布反應(yīng)中發(fā)揮作用。p38MAPK抑制劑SB20358

3、0可抑制LPS所致肺部炎癥反應(yīng)。我們假設(shè)p38MAPK和STAT3信號通路間存在關(guān)聯(lián)。本實驗以小鼠AM為研究對象，觀察SB203580對LPS誘導(dǎo)的MH-S細(xì)胞上清液IL-10及STAT3活化的影響，探討p38MAPK與STAT3間關(guān)系，為臨床治療ILD提供新的思路。
　　方法：
　　1.ELISA法測定細(xì)胞上清液IL-10濃度：復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)MH-S細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×106/ml于24孔板中過夜，隨機分組刺激后收集細(xì)

4、胞上清液，用ELISA試劑盒檢測IL-10濃度。分組：①對照組：加入與實驗組等體積的無血清RPMI1640培養(yǎng)液；②LPS組：終濃度100ng/ml LPS；③LPS+SB5組：加入終濃度5μM SB203580，20min后加入終濃度100 ng/ml LPS；④LPS+SB10組：加入終濃度10μMSB203580，20min后加入終濃度100 ng/ml LPS；⑤LPS+SB15組：加入終濃度15μM SB203580，20mi

5、n后加入終濃度100 ng/ml LPS。各組分別刺激90min、2h、4h、6h、12h取細(xì)胞上清液，凍存于-80℃，待ELISA檢測IL-10濃度。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)法測定STAT3和磷酸化STAT3的表達變化。調(diào)整細(xì)胞濃度106/ml，于24孔板爬片過夜，按以下分組分別測定STAT3和磷酸化STAT3的表達。分組：①對照組：加入與實驗組等體積的無血清RPMI1640培養(yǎng)液；②LPS15min組：終濃度100 ng/ml

6、LPS；③LPS15min+SB10組：加入終濃度10μM SB203580，20min后加入終濃度100 ng/ml LPS。
　　結(jié)果：
　　1.ELISA測定細(xì)胞上清液中IL-10含量的變化：LPS刺激MH-S細(xì)胞后，細(xì)胞上清液中IL-10含量增加，LPS刺激90min，IL-10含量開始升高，6h達最高值，12h含量降低。經(jīng)單因素方差分析，對照組、LPS組與SB+LPS組，三組間IL-10表達水平有顯著性差異(P＜0

7、.05)。SB203580(5μM、10μM和15μM)預(yù)處理顯著抑制LPS誘導(dǎo)的IL-10含量增加，SB203580組無顯著量效關(guān)系(P＞0.05)，IL-10含量仍高于對照組。
　　2.免疫細(xì)胞化學(xué)測定STAT3和磷酸化STAT3的表達變化。①STAT3的表達變化：對照組及試驗組均細(xì)胞質(zhì)黃染，經(jīng)單因素方差分析，各組間STAT3表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；②磷酸化STAT3的表達變化：對照組僅見微弱黃染，LPS15

8、min組細(xì)胞核黃染增強，LPS15min+SB10組細(xì)胞核黃染變淡。經(jīng)單因素方差分析，兩個實驗組與對照組比較，磷酸化STAT3表達均顯著增高(P＜0.05)；與LPS15min組比較，LPS15min+SB10組磷酸化STAT表達顯著降低(P＜0.05)，但與對照組比較LPS15min+SB10組磷酸化STAT3表達仍顯著增高(P＜0.05)。
　　數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。各組用單因素方差分析(One wayANOVA)

9、進行比較。如有顯著性用Student-Newman-Keuls(SNK-q)檢驗，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.LPS刺激MH-S細(xì)胞引起細(xì)胞上清中IL-10分泌增加；用p38MAPK抑制劑SB203580干預(yù)后，IL-10的分泌減少，仍高于對照組，提示SB203580可能抑制IL-10分泌。隨著SB203580劑量增加，IL-10含量差異不顯著，提示SB203580劑量增加可能對抗炎細(xì)胞因子IL-10