鴨源雞桿ompW基因?qū)w抗逆和致病性的影響機(jī)制及flfA基因突變菌株的構(gòu)建.pdf

1、鴨源雞桿菌（Gallibacterium anatis，G.anatis）是一種革蘭氏陰性菌，為巴氏桿菌科雞桿菌屬的代表種。鴨源雞桿菌感染蛋雞后往往造成以腹膜炎和輸卵管炎為主的病理變化，導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋量下降、死亡率升高。該菌的多重耐藥性使得抗生素治療鴨源雞桿菌病的效果不甚理想。用目前部分已知致病因子作為抗原的傳統(tǒng)疫苗均無法提供理想的保護(hù)效果。新型疫苗的研制是當(dāng)前鴨源雞桿菌病防控研究的重點(diǎn)，而鴨源雞桿菌致病因子及致病機(jī)理的研究和鑒定是迫切需

2、要解決的關(guān)鍵問題。
　　外膜蛋白W(Outer membrane proteinW，OmpW)在革蘭氏陰性菌生物被膜形成、黏附、耐應(yīng)激中發(fā)揮重要作用;菌毛通常在細(xì)菌黏附宿細(xì)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。但這兩個(gè)因子在鴨源雞桿菌的具體作用還未被闡明。為了解OmpW及菌毛在鴨源雞桿菌各種生物學(xué)功能中的作用，進(jìn)一步闡明該菌的致病機(jī)理，本研究進(jìn)行了以下幾個(gè)方面的研究。主要研究結(jié)果報(bào)告如下:
　　1.鴨源雞桿菌ompW缺失菌株ΔompW的構(gòu)建及生物

3、學(xué)特性研究
　　鑒于外膜蛋白在革蘭氏陰性細(xì)菌的黏附、抗應(yīng)激、耐藥等各種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用，本研究利用M-Ⅳ培養(yǎng)基制備鴨源雞桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用自然轉(zhuǎn)化法將上下游同源臂和氯霉素抗性基因組構(gòu)成的線性打靶序列轉(zhuǎn)化鴨源雞桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR和Western Blotting鑒定表明成功構(gòu)建了ompW缺失菌株ΔompW。然后比較了鴨源雞桿菌RZ和ΔompW的生長性能及溶血活性，發(fā)現(xiàn)ompW缺失對鴨源雞桿菌的生長速度、菌落形態(tài)大小及溶血

4、活性沒有影響，表明OmpW不參與鴨源雞桿菌的這些生物學(xué)特性。最后應(yīng)用微量稀釋法測定了12種抗菌藥物對鴨源雞桿菌RZ和ΔompW的MIC，結(jié)果顯示相比鴨源雞桿菌親本菌株，ΔompW對土霉素和四環(huán)素的敏感性顯著提高(p＜0.01)，二者的MIC值分別降低了8(128/16)和32(128/4)倍，表明OmpW在鴨源雞桿菌抗四環(huán)素類藥物中發(fā)揮重要作用。
　　2.RZ和ΔompW的抗應(yīng)激研究
　　在構(gòu)建ΔompW的基礎(chǔ)上，分析了鴨源

5、雞桿菌RZ和ΔompW在不同NaCl濃度培養(yǎng)基中的生長情況，并用SDS-PAGE和Western Blotting分析鴨源雞桿菌外膜蛋白的表達(dá)水平，最后用RT-qPCR分析了不同鹽度下鴨源雞桿菌OmpW mRNA的轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果顯示在高鹽培養(yǎng)基(3％NaCl)中兩者的對數(shù)期推遲，生長均受到影響，但RZ的生長速度高于ΔompW的生長速度;隨著培養(yǎng)時(shí)間時(shí)間增加，ΔompW的生長受到的影響更大。表明RZ比ΔompW更耐受高滲透環(huán)境，Δo

6、mpW的生長受高滲透環(huán)境影響更大。與正常BHI培養(yǎng)時(shí)相比，RZ在高NaCl含量BHI培養(yǎng)時(shí)OmpW的表達(dá)被上調(diào)，與此對應(yīng)的是鴨源雞桿菌也上調(diào)了OmpW mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，提示OmpW可能在鴨源雞桿菌抵抗?jié)B透應(yīng)激中發(fā)揮一定作用。在熱應(yīng)激、滲透壓力及氧化應(yīng)激環(huán)境下，ΔompW均低于RZ對應(yīng)激的抵抗率，表明OmpW與抗應(yīng)激能力有一定的相關(guān)性。
　　3.RZ和ΔompW抗血清殺菌機(jī)制研究
　　本研究分析了RZ和ΔompW在血清含量

7、不同的培養(yǎng)基中的生存率，隨后用Western Blotting和RT-qPCR分別分析了兩者在不同血清濃度下的OmpW表達(dá)水平及其mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明RZ和ΔompW在低濃度血清中的生存率差別不顯著(p＞0.05)，隨著血清含量增加，ΔompW的生存能力逐漸低于RZ的生存能力;該結(jié)果提示OmpW可能在鴨源雞桿菌抗血清殺菌活性中發(fā)揮重要作用。為進(jìn)一步闡明鴨源雞桿菌OmpW在抵抗補(bǔ)體殺菌活性中的作用，筆者將RZ與雞正常血清或熱滅活血清

8、一起孵育，用Western Blotting方法分析了OmpW的變化。與對照組相比（滅活血清處理），細(xì)菌用雞正常血清處理后其OmpW的表達(dá)及其mRNA的轉(zhuǎn)錄升高;上述結(jié)果表明OmpW與該菌抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的殺菌活性有關(guān)。
　　為初步探索鴨源雞桿菌抵抗補(bǔ)體殺菌的通路，將RZ和ΔompW分別與雞血清+EDTA（抑制所有補(bǔ)體通路）或血清+EGTA-Mg2+（僅允許補(bǔ)體旁路通路激活）。結(jié)果顯示EDTA存在時(shí)，兩株細(xì)菌的生存率幾乎沒有差異，而且

9、與對照組細(xì)菌的生存率相似;血清中加入EGTA-Mg2+時(shí)，兩株細(xì)菌的生存率均降低，說明補(bǔ)體旁路通路介導(dǎo)了補(bǔ)體殺菌活性;血清中加入EGTA-Mg2+時(shí)，ΔompW的生存率明顯低于RZ的生存率(p＜0.05)。這些結(jié)果提示OmpW通過抑制旁路通路發(fā)揮抗補(bǔ)體殺菌活性。
　　4.RZ和ΔompW致病性的研究
　　分析了RZ和ΔompW對小鼠的半數(shù)致死量(Median lethal dose，LD50)及小鼠感染后的生存能力。結(jié)果顯示

10、RZ和ΔompW對小鼠LD50分別為2.93×108CFU和4.08×108CFU;相對于RZ，ompW缺失使ΔompW對小鼠的LD50提高;-ΔompW感染組小鼠的生存率高于RZ感染組小鼠的生存率，兩組小鼠在臨床癥狀上沒有眼觀差異;小鼠的病理變化主要包括腸道腸壁變薄且透明，腸、肺臟、肝臟和脾臟出血，但兩組小鼠的病理變化無肉眼可見差異。上述結(jié)果表明ompW缺失導(dǎo)致鴨源雞桿菌對小鼠的致病力有降低，但差異很小。
　　隨后測定了RZ和Δ

11、ompW生物被膜形成能力和對雞原代輸卵管上皮細(xì)胞的黏附性能，結(jié)果顯示二者形成生物被膜能力均較弱，無顯著差異(p＞0.05);兩者黏附雞原代輸卵管上皮細(xì)胞的數(shù)量隨著孵育時(shí)間增加而增加，ΔompW的黏附數(shù)量低于RZ的黏附數(shù)量，但差異不顯著(p＞0.05)。上述結(jié)果表明OmpW參與了鴨源雞桿菌對雞原代輸卵管上皮細(xì)胞的黏附，對生物被膜形成影響很小。
　　5.鴨源雞桿菌菌毛結(jié)構(gòu)蛋白缺失菌株ΔflfA的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究
　　利用上述

12、自然轉(zhuǎn)化法，用上下游同源臂和氯霉素抗性基因構(gòu)成的線性打靶片段轉(zhuǎn)化鴨源雞桿菌感受態(tài)細(xì)胞，PCR和Western Blotting鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，結(jié)果顯示突變菌株不表達(dá)菌毛結(jié)構(gòu)蛋白，成功構(gòu)建了菌毛結(jié)構(gòu)蛋白缺失菌株ΔflfA;隨后分析了鴨源雞桿菌RZ和ΔflfA的生長性能和雞原代輸卵管上皮細(xì)胞黏附性能。結(jié)果顯示FlfA的缺失沒有影響鴨源雞桿菌的生長性能和菌落形態(tài);RZ和ΔflfA對雞原代輸卵管上皮細(xì)胞的黏附數(shù)量隨孵育時(shí)間的增加而增多，而Flf

13、A的缺失使ΔflfA的黏附數(shù)量顯著低于RZ的黏附數(shù)量(p＜0.05)。表明F17樣菌毛蛋白在鴨源雞桿菌黏附雞原代輸卵管上皮細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
　　綜上所述，作者用自然轉(zhuǎn)化法成功構(gòu)建了鴨源雞桿菌突變菌株ΔompW和ΔflfA，不僅為OmpW和FlfA功能研究奠定了良好的基礎(chǔ)，而且為該菌其它基因的研究將提供了可靠的技術(shù)平臺。OmpW在鴨源雞桿菌抗四環(huán)素類藥物中發(fā)揮重要作用;OmpW在鴨源雞桿菌適應(yīng)不同鈉離子濃度中發(fā)揮重要作用，且與鴨