臨床雞源致病性耐藥空腸彎曲桿菌的基因組學(xué)研究.pdf

1、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)是一種在世界范圍內(nèi)引起人類胃腸炎的主要食源性致病菌，嚴(yán)重感染時也可能引起格林-巴利綜合癥、米歇爾綜合征和菌血癥。隨著近年越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，空腸彎曲桿菌的耐藥問題日益嚴(yán)重，由空腸彎曲桿菌感染引起的人類及動物性疾病也越來越多。為了更有效的預(yù)防和控制耐藥空腸彎曲桿菌以及由其引發(fā)疾病的產(chǎn)生，必須了解清楚致病性耐藥菌的產(chǎn)生原因及其耐藥和毒性的產(chǎn)生機(jī)制。本實驗室前期在臨床上采集了疑似空腸彎曲

2、桿菌樣本，本實驗以6株雞源菌株為研究對象，通過耐藥表型和毒力表型試驗篩選出了一株具有多重耐藥且致病性相對較強(qiáng)的菌株(編號為1655)，并通過全基因組從頭測序技術(shù)，運用分子生物學(xué)手段對篩選出的菌株進(jìn)行基因組特征、耐藥機(jī)制及致病機(jī)制的分析，并試圖闡明耐藥和毒力之間的關(guān)系。本課題在一定程度上解釋了臨床致病性耐藥空腸彎曲桿菌的發(fā)生機(jī)理，并為生物信息庫提供了有利數(shù)據(jù)，同時為防止彎曲桿菌耐藥性和致病性的產(chǎn)生和傳播提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。
　

3、　1.臨床疑似空腸彎曲菌菌株的PCR鑒定和MIC測定
　　將實驗室之前用甘油保存于-80℃的6株疑似空腸彎曲桿菌的菌株(編號分別為1442、1447、1614、1622、1655和1685)以及RM1221和ATCC33560進(jìn)行復(fù)蘇。用微量移液槍取出50μL涂布于預(yù)先準(zhǔn)備好的改良Skirrow氏血平板上，接種好后置42℃微需氧孵育24-48h左右，觀察菌落形態(tài)，然后挑取單菌落于MH肉湯中傳代兩次。提取細(xì)菌基因組DNA，根據(jù)查閱文

4、獻(xiàn)設(shè)計鑒定空腸彎曲桿菌的兩對引物16S和mapA，對復(fù)蘇的疑似菌株進(jìn)行PCR鑒定，兩對引物的擴(kuò)增片段長度分別是857bp和589bp，經(jīng)PCR鑒定以及測序分析，最終確定6株疑似菌株均為空腸彎曲桿菌。
　　采用瓊脂稀釋法進(jìn)行6株菌的藥物敏感性試驗，以ATCC33560作質(zhì)控。主要關(guān)注常用于空腸彎曲桿菌病治療的四大類藥物，分別是氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和氨基糖苷類。選取這四大類藥物的8種代表藥測定MIC。結(jié)果顯示:6株菌對這8

5、種藥物均產(chǎn)生了耐藥性，可見臨床菌株的耐藥現(xiàn)象還是非常嚴(yán)重的。
　　2.臨床空腸彎曲菌的體內(nèi)毒性試驗以及LD50的測定
　　以預(yù)試劑量1×109CFU/mL（通過計數(shù)得到）的菌液1mL采用腹腔注射感染雛雞，1442、1622和1655組在24h內(nèi)都出現(xiàn)了不同程度的死亡，其中以1655組最為嚴(yán)重，因此，初步篩選這3株菌進(jìn)行LD50的測定，方法為改良寇氏法。
　　結(jié)果顯示:以濃度3.7×108CFU/mL菌液1mL口服感染2

6、日齡的健康雛雞，感染兩周后1442和1622組只有高濃度組出現(xiàn)了1-2只的死亡，因此無法計算LD50，而1655組在不同濃度出現(xiàn)了不同的死亡率，計算出的LD50為8.45×107CFU/mL。以同樣濃度和劑量對2日齡的健康雛雞進(jìn)行腹腔注射感染，雖然1442組和1622組在不同濃度下出現(xiàn)了不同的死亡率，但1655組在最低濃度3.7×105CFU/mL下也出現(xiàn)了100％的死亡率。結(jié)合口服感染的實驗結(jié)果，說明1655菌株具有相當(dāng)強(qiáng)的毒力。同樣

7、再以3.1×108CFU/mL的劑量腹腔注射感染16日齡的小雞，1442和1622組基本沒出現(xiàn)死亡，但1655組出現(xiàn)了相當(dāng)高的死亡率，LD50為1.60×107CFU/mL。因此，初步斷定1655菌株具有一定的致病性。
　　3.細(xì)菌黏附、侵襲以及胞外生存能力的考察
　　LD50的測定考察了菌株的體內(nèi)毒性情況，還需對菌株的體外毒性進(jìn)行檢測，包括檢測菌株對細(xì)胞的侵襲和黏附能力，以及菌株在體外的生存活力。選用RAW264.7細(xì)胞，

8、采用慶大霉素保護(hù)法對初篩的1442、1622以及1655菌株進(jìn)行細(xì)胞實驗，RM1221作為參照菌。結(jié)果顯示:3株臨床菌株的黏附和侵襲能力與RM1221相比都有顯著性差異。但就3株臨床菌而言，它們之間的黏附和侵襲能力沒有顯著差異，結(jié)合胞內(nèi)生存能力實驗，1442可以存活至48h，而1622和1655可以存活至72h，并且可以明顯看出，在每個時間點，1655菌株的侵襲數(shù)還是明顯比1622高，可能這也是它表現(xiàn)出比其它兩株菌毒性更強(qiáng)的原因。因此后

9、續(xù)試驗將1655菌株作為重點研究對象，對其進(jìn)行全基因組測序分析相關(guān)耐藥和毒性機(jī)制。
　　4.全基因組從頭測序-De novo測序
　　用試劑盒提取靶菌1655的基因組，樣品送自公司進(jìn)行質(zhì)檢、文庫構(gòu)建以及質(zhì)控等工作，然后上機(jī)測序，選定的測序方法為Solexa，本測序?qū)嶒炓鬄殡p端測序，讀長為100nt，構(gòu)建一個隨機(jī)文庫。測序完成后進(jìn)行Contig的拼接、基因組環(huán)狀草圖的完成、基因組的預(yù)測以及注釋等工作，然后運用生物信息學(xué)技術(shù)對

10、測序結(jié)果進(jìn)行耐藥和毒性機(jī)制的分析。結(jié)果顯示:1655菌株存在已報道的引起這四類藥物高水平耐藥的機(jī)制，如引起氟喹諾酮類藥物高水平耐藥的gyrA基因上的Thr-86-Ile位點的突變，大環(huán)內(nèi)酯類23SrRNA上A2075G位點的突變，介導(dǎo)四環(huán)素和氨基糖苷類耐藥的tetO外源基因的獲得以及導(dǎo)致氨基糖苷類耐藥aph-A和aadE基因的存在。并且預(yù)測到了一個編碼未知功能蛋白質(zhì)的基因位于質(zhì)粒pCG8245上，此質(zhì)粒為一個抗性質(zhì)粒，對于其編碼的未知功

11、能的蛋白質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究，或許可以發(fā)現(xiàn)新的耐藥機(jī)制。此外，還發(fā)現(xiàn)了一些之前沒有報道過的突變和缺失，或許與菌株的多重耐藥有關(guān)。對毒性機(jī)制的分析結(jié)果:基因序列分析表明，1655菌株除了攜帶對致病性產(chǎn)生作用的毒力因子外，沒有注釋到編碼毒力基因的噬菌體、毒力島以及與Ⅳ型分泌系統(tǒng)同源的基因，但已知的致病因素（比如，攜帶的毒力因子）或許可以解釋它的致病性;比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了大量的SNPs;通過與參考基因組RM1221、11168以及81-176

12、的共線性分析發(fā)現(xiàn)1655菌株基因組存在嚴(yán)重的缺失、重排以及倒位現(xiàn)象（包括內(nèi)部編碼和基因間區(qū)域），這表明適度的遺傳變化可能使1655的毒力增強(qiáng)。此外，在1655菌株染色體上存在的與毒性相關(guān)的可變基因區(qū)、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、鐵攝取系統(tǒng)以及發(fā)現(xiàn)的質(zhì)粒pTet可能都參與了菌株的毒性機(jī)制。分析結(jié)果還顯示，菌株間的基本基因內(nèi)容存在差異，這也為后續(xù)的分析提供了新的視角。另外還預(yù)測到了一些未知功能的蛋白質(zhì)、發(fā)生突變?nèi)笔У男蛄幸约芭c對照菌株有差異的生物學(xué)成分

13、，這些基因的共同作用或許會對細(xì)菌的耐藥和毒力產(chǎn)生影響。鑒于臨床分離株復(fù)雜的環(huán)境背景，導(dǎo)致其產(chǎn)生致病性的原因也比較復(fù)，因此僅從基因組內(nèi)容和結(jié)構(gòu)差異上進(jìn)行分析不夠全面，有些機(jī)制無法解釋清楚。
　　綜上所述，本試驗通過一系列耐藥和毒性實驗成功篩選出了一株具有致病性的多重耐藥菌株，并通過全基因組測序的方法，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了深入分析，闡明了臨床菌株產(chǎn)生多重耐藥以及致病性的原因，對于其復(fù)雜的耐藥和致病機(jī)制也進(jìn)行了初步分析，