CBL調節(jié)死亡受體在脂筏內重新分布參與奧沙利鉑增強TRAIL誘導胃癌細胞凋亡.pdf

1、目的： 胃癌是世界范圍內最常發(fā)生的惡性腫瘤之一，在亞洲國家是腫瘤死亡的主要原因。多數(shù)患者在診斷時已經(jīng)是進展期或發(fā)生轉移，5年生存率只有10％—15％?；熓侵委熗砥谖赴┑闹饕侄巍１M管化療藥物的應用使晚期病人的生存期有所延長，但中位總生存時間很難超過12個月。生物治療有選擇性治療惡性腫瘤的潛力，因此具有很好的治療前景。腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)是腫瘤壞死因子家族的成員之一。在體外研究中，TRAIL誘導許多腫瘤細胞

2、的凋亡，對多數(shù)正常細胞沒有毒性。但胃癌細胞對TRAIL相對不敏感。 TRAIL誘導的凋亡信號傳遞需要結合死亡受體4(DR4)和死亡受體5(DR5)。TRAIL與DR4和DR5結合后導致受體聚集，并募集Fas相關蛋白死亡結構域(FADD)和前caspase—8、前caspase—10，共同形成死亡誘導信號復合物(DISC)。DISC的形成促發(fā)下游效應物caspase并誘導凋亡。脂筏能為死亡受體聚集提供膜交換平臺。最近的研究表明脂

3、筏在啟動死亡信號轉導時發(fā)揮了重要作用。這些結果提示脂筏功能的失調也許是胃癌對TRAIL不敏感的原因之一。 某些化療藥物，比如表阿霉素、紫杉醇、順鉑，能夠增強腫瘤細胞對TRAIL的敏感性。奧沙利鉑是第三代含鉑藥物，奧沙利鉑為基礎的化療方案對胃癌的療效優(yōu)于順鉑為基礎的方案。有研究報道順鉑通過促進脂筏聚集增強了結腸癌細胞對Fas配體的敏感性。是否奧沙利鉑能通過調節(jié)脂筏從而增強胃癌細胞對TRAIL的敏感性還不清楚。 脂筏的功能受

4、多種因素的調節(jié)。泛素連接酶Cbl家族是重要的調節(jié)因素。Cbl蛋白包括3個同源體，c—Cbl，Cbl—b和Cbl—3。c—Cbl和Cbl—b有相似的結構和功能。有研究報告c—Cbl和Cbl—b能夠從T細胞和肥大細胞的脂筏中清除信號分子，導致脂筏無效聚集。此外，T細胞Cbl—b的缺失能促進抗原誘導的受體聚集和脂筏聚集。但是c—Cbl和Cbl—b是否能調節(jié)胃癌細胞的脂筏，并因此影響胃癌細胞對TRAIL的敏感性尚不明確。 為增強胃癌細胞

5、對TRAIL的敏感性，我們將奧沙利鉑和TRAIL聯(lián)合應用。本實驗以人胃癌細胞株MGC803，BGC823，SGC7901為模型，對脂筏在奧沙利鉑和TRAIL聯(lián)合誘導細胞凋亡過程中的作用進行了研究，同時對脂筏聚集的調節(jié)因子c—Cbl和Cbl—b在此過程中的調控機制進行了初步探討。 材料與方法： 1、采用MTT法測定細胞活力。 2、采用流式細胞儀通過PI—Annexin V染色進行細胞凋亡判定。 3、采用流式

6、細胞儀通過DiOC6染色進行線粒體跨膜電位測定。 4、采用Western blot檢測c—Cbl，Cbl—b，caspase—3，caspase—8，Bax，Bcl—2蛋白的表達。 5、采用免疫熒光顯微技術觀察細胞膜脂筏和死亡受體的分布。 6、采用Lipofectamine2000試劑進行瞬時轉染。 7、統(tǒng)計學處理：每次實驗重復3次，數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間差異采用Student's t test分析。P

7、<0.05有統(tǒng)計學意義。 實驗結果： 1、在MGC803，BGC823和SGC7901細胞中，100ng/mL的TRAIL導致輕度的增殖抑制，誘導不超過6％的細胞凋亡。奧沙利鉑在MGC803，BGC823和SGC7901細胞中24h抑制細胞增殖50％的藥物濃度(IC50)分別是22.56±6.55，37.47±7.67和33.92±8.01μg/mL。與單藥奧沙利鉑和TRAIL相比，奧沙利鉑(各自的IC50劑量)聯(lián)合TR

8、AIL(100ng/mL)引起明顯的細胞增殖抑制和細胞凋亡。當奧沙利鉑和TRAIL聯(lián)合作用MGC803細胞后，可以見到更明顯的線粒體跨膜電位下降，caspase—3和caspase—8裂解，Bcl—2表達下調。5—FU和TRAIL協(xié)同誘導胃癌細胞凋亡已有報道，在本實驗中作為陽性對照。5—FU作用MGC803細胞48h抑制細胞增殖50％的藥物濃度(IC50)是2.07±1.14μg/mL。與單藥5—FU和TRAIL相比，5—FU(48h的

9、IC50劑量)聯(lián)合TRAIL(100ng/mL)引起明顯的細胞增殖抑制和細胞凋亡。當5—FU和TRAIL聯(lián)合作用MGC803細胞后，可以見到更明顯的線粒體跨膜電位下降，caspase—3和caspase—8裂解，Bcl—2表達下調。 2、與對照組相比，100 ng/mL TRAIL作用MGC803細胞沒有引起明顯的脂筏聚集和DR4，DR5聚集。但是22.56μg/mL奧沙利鉑明顯促進DR4和DR5在聚集脂筏內的定位。奧沙利鉑和T

10、RAIL聯(lián)合作用與奧沙利鉑單藥相比，引起脂筏和死亡受體共聚集的程度相似。 3、制霉菌素是一種膽固醇分離劑能破壞脂筏。用50μg/mL制霉菌素預處理MGC803細胞1h，部分阻止了奧沙利鉑引起的脂筏聚集和DR4，DR5聚集。制霉菌素處理MGC803細胞24h后引起了少量的細胞凋亡。加入奧沙利鉑前用制霉菌素預處理1h，有減少奧沙利鉑誘導細胞凋亡的趨勢。此外，加入奧沙利鉑和TRAIL前用制霉菌素預處理1h，凋亡細胞的比率由41.79±

11、5.48％減少到29.52±3.99％。 4、22.56μg/mL奧沙利鉑作用MGC803細胞8h后輕度抑制了c—Cbl和Cbl—b的表達，處理16h和24h后明顯減少了c—Cbl和Cbl—b的表達。100ng/mL TRAIL作用MGC803細胞16h沒有改變c—Cbl的表達，但輕度上調了Cbl—b的表達。奧沙利鉑和TRAIL聯(lián)合作用MGC803細胞16h后，下調c—Cbl和Cbl—b的程度與單藥奧沙利鉑下調的程度相似。

12、 5、使用Lipo2000瞬時轉染野生型c—Cbl和Cbl—b的表達載體進入MGC803細胞，轉染48h后用Western blot的方法證實c—Cbl和Cbl—b的表達量提高。與陰性對照相比，在c—Cbl，Cbl—b，c—Cbl聯(lián)合Cbl—b轉染的細胞中，奧沙利鉑，奧沙利鉑+TRAIL誘導的MGC803細胞脂筏聚集被部分抑制。 結論： 1、奧沙利鉑增強TRAIL誘導的MGC803，BGC823和SGC7901細胞凋亡

13、。在協(xié)同作用中有更明顯的線粒體跨膜電位下降，caspase—3和caspase—8裂解，Bcl—2表達下調。5—FU和TRAIL作用胃癌細胞后也有相似的結果。 2、奧沙利鉑促進MGC803細胞的DR4和DR5募集在聚集的脂筏內。 3、制霉菌素部分阻止了奧沙利鉑誘導的脂筏聚集和DR4，DR5聚集，并減少了奧沙利鉑和TRAIL誘導的MGC803細胞凋亡。 4、在MGC803細胞內，奧沙利鉑下調了c—Cbl和Cbl—b