丹參酮ⅡA抑制瘢痕疙瘩的實驗研究.pdf

1、一、研究背景
　　 瘢痕疙瘩是一種持續(xù)生長并超出原皮膚創(chuàng)緣的病理性瘢痕，以成纖維細胞的不斷增殖及細胞外基質(zhì)特別是膠原的過度沉積為特征，被視為人類獨有的真皮成纖維細胞腫瘤。瘢痕疙瘩不僅僅影響美觀，而且常伴有瘙癢和疼痛感等局部癥狀，甚至導致局部功能障礙，給患者的生理和精神上都帶來了巨大的痛苦。
　　 瘢痕疙瘩成纖維細胞與其他正常成纖維細胞相比，其Ⅰ型膠原及纖維粘連蛋白過度表達以及膠原多肽的降解降低導致細胞外基質(zhì)過度沉積;VE

2、GF、TGF-β1、TGF-β2等生長因子及PDGF-α受體等生長因子受體的過度表達，同時瘢痕疙瘩成纖維細胞對生長因子的刺激反應敏感;瘢痕疙瘩成纖維細胞增生及凋亡失衡，瘢痕疙瘩組織中成纖維細胞的凋亡率要明顯低于正常皮膚組織中成纖維細胞。這些差異都是引起瘢痕疙瘩形成的重要原因。
　　 瘢痕疙瘩是整形科常見疾病，但也是臨床工作所面臨的治療難點，現(xiàn)常采用手術(shù)切除、激光治療、類固醇藥物注射、硅凝膠治療、放射治療、5-氟尿嘧啶注射等治療方

3、法的綜合運用，這些方法取得了一定的療效，但也存在各自的不足，因此至今尚缺乏瘢痕疙瘩的理想治療方法。
　　 現(xiàn)常用的瘢痕疙瘩治療方法中，5-氟尿嘧啶注射治療、激光治療、皮質(zhì)類固醇激素注射及射線治療的治療原理之一即是誘導瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡，抑制其增殖。有研究者提出，現(xiàn)今瘢痕疙瘩治療效果欠佳也與細胞凋亡有關(guān)，一方面是人為誘導凋亡仍然不足，另一方面是可能是誘導凋亡過度，導致其他種類細胞死亡，引發(fā)新的修復后，而造成延遲性的增生?？梢姡?/p>

4、尋找瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡缺陷機制以及有效誘導其凋亡對瘢痕疙瘩治療具有重要意義。
　　 近年來，在中藥或中藥提取物治療瘢痕疙瘩的研究方面取得了一定的進展。研究指出丹參與黃芪的混合提取物(CASE)可通過調(diào)節(jié)TGF-β/Smad通路，抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖、侵襲及膠原合成的作用，但CASE具體有效成分并不十分明確。
　　 CASE主要成分之一的丹參是具有很多藥理作用的活血化瘀藥，主要成份包括丹參酮(Ⅰ、ⅡA、ⅡB)、異

5、丹參酮(Ⅰ、Ⅱ)等。其中，而丹參酮ⅡA是丹參中主要有效成分之一，其標準品穩(wěn)定易得。丹參酮ⅡA含有醌型結(jié)構(gòu)，易被氧化還原，可參與機體的多種生化反應而有多種生物活性。
　　 近來研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可誘導多種人類腫瘤細胞的凋亡，可誘導白血病THP-1細胞、人肝癌細胞、人宮頸癌細胞、人乳腺癌細胞以及人結(jié)腸癌細胞凋亡的作用。并且有報道指出，兔耳增生性瘢痕模型中，丹參酮ⅡA對兔耳增生性瘢痕有明顯的抑制作用;丹參酮ⅡA具有抑制膽管來源成纖維

6、細胞增殖及膠原的分泌，誘導MMP-9mRNA的表達而促進膠原降解，抑制膽道瘢痕的形成的作用。考慮丹參酮ⅡA可能對瘢痕疙瘩成纖維細胞也具有同樣的抑制增殖，誘導凋亡的作用，可用于瘢痕疙瘩的治療。
　　 由于瘢痕疙瘩是人類所特有的病理性瘢痕，至今尚無理想的瘢痕疙瘩動物模型，因而增加了瘢痕疙瘩的研究難度。現(xiàn)瘢痕疙瘩動物模型的建立主要有以下三種:①在動物身上誘導出類似瘢痕疙瘩的瘢痕增生模型;②將人的瘢痕疙瘩移植于免疫缺陷動物體內(nèi);③應用組

7、織工程的原理和方法構(gòu)建人瘢痕疙瘩動物模型。
　　 第一種動物模型的瘢痕增生程度和人體瘢痕差距明顯，該模型仍存在很多爭論，治療評價研究所得結(jié)果可信度受到影響;第三種應用組織工程的原理和方法構(gòu)建人瘢痕疙瘩動物模型的方法尚不十分成熟，相關(guān)文獻報道不多，還需進一步研究探討，第二種動物模型自1985年，Shetlar首次報道，隨后Estrem及Kischer等人進行了類似的研究，證實了該動物模型的可行性。此后，我國學者在此基礎(chǔ)上也開展了進

8、一步的研究。他們研究發(fā)現(xiàn)，裸鼠瘢痕疙瘩模型中移植于裸鼠皮下的瘢痕疙瘩組織能基本保持原有的組織學形態(tài)和生物學形態(tài)，具有較好的可操作性和可復制性。并且在裸鼠的瘢痕疙瘩模型建立過程中，保留表皮的裸鼠瘢痕疙瘩模型更能維持瘢痕疙瘩原有的生物學特性。并有研究明確指出，瘢痕疙瘩組織植入后的1～4周是良好的實驗干預時機，是一個相對理想的瘢痕疙瘩模型。
　　 二、研究目的
　　 本實驗研究是體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞后，給予丹參酮ⅡA干預

9、，并與對照組進行比較，觀察體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞細胞增殖，細胞凋亡及細胞周期的變化，探討丹參酮ⅡA對體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞細胞的影響。將瘢痕疙瘩組織塊植入裸鼠皮下，制作瘢痕疙瘩裸鼠模型，觀察該動物模型的可靠性，并于裸鼠腹腔注射丹參酮ⅡA，與對照組進行比較，觀察瘢痕疙瘩組織塊的大體形態(tài)變化，組織學形態(tài)變化，特別是細胞凋亡情況。
　　 三、方法
　　 1.實驗組織來源:所用瘢痕疙瘩組織均取自上海交通大學附屬上海市第九

10、人民醫(yī)院整形外科的17例瘢痕疙瘩患者。術(shù)前患者符合瘢痕疙瘩的臨床診斷標準，術(shù)后病理證實與臨床診斷一致。且患者無長時間外用瘢痕防治藥物史，不伴有腫瘤及其他嚴重疾病。
　　 2.體外培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細胞，實驗所用的細胞為第1～2代細胞。
　　 3.體外培養(yǎng)細胞干預實驗分組:本部分實驗采用析因設(shè)計分組，按照干預濃度分別為(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)，于不同干預時間點進行觀察細胞增殖，

11、凋亡及周期情況變化，并以0ug/ml組作為對組進行比較。每組樣本量3-4例。
　　 4.CCK-8比色法制作標準曲線，并測定瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖情況。
　　 5.流式細胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞凋亡情況，比較細胞早期凋亡率的差別。
　　 6.流式細胞術(shù)PI法DNA染色檢測瘢痕疙瘩成纖維細胞的細胞周期情況，比較G0/G1期細胞比例的差別。
　　 7.瘢痕疙瘩裸鼠移植模

12、型的制作:將手術(shù)切取的瘢痕疙瘩組織，無菌條件下制成保留表皮的組織塊，大小均為8mm×5mm×5mm，植入裸鼠右側(cè)肩胛皮下腔隙內(nèi)。
　　 8.瘢痕疙瘩裸鼠模型干預實驗分組及給藥方法:15只裸鼠模型在瘢痕疙瘩組織塊植入后第16天，從中隨機抽取3只裸鼠，對植入的瘢痕疙瘩組織的進行大體形態(tài)觀察及組織學觀察，以明確瘢痕疙瘩組織塊植入第16天后組織的血供及組織存活情況;另外12只隨機分成2組，每組各6只。一組為實驗組，腹腔注射丹參酮ⅡA5m

13、g;一組為對照組，腹腔注射等量生理鹽水，兩組均連續(xù)注射14天后處死裸鼠，取出植入的瘢痕疙瘩組織，對植入的瘢痕疙瘩組織的進行大體形態(tài)觀察及組織學觀察。
　　 9.瘢痕疙瘩組織的大體形態(tài)觀察，觀察植入組織塊表面的血管情況，有無組織的萎縮壞死，并測量組織塊大小。
　　 10.瘢痕疙瘩組織石蠟切片后HE染色和Masson三色法染色進行組織學觀察
　　 11.瘢痕疙瘩組織冰凍切片后Tunel法凋亡細胞染色觀察
　　

14、 12.數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學分析方法:用SPSS13.0進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)用x±s表示。細胞增殖活性、細胞早期凋亡率和G0/G1期細胞比例的比較采用析因設(shè)計方差分析，兩兩比較采用LSD法;瘢痕疙瘩組織塊體積大小的比較采用兩獨立樣本t檢驗的方法，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義的標準。
　　 四、結(jié)果
　　 1.CCK-8比色法制作標準曲線，其決定系數(shù)R2=0.96，回歸方程為Y=-359.51+15211.73X(Y為瘢痕疙瘩成

15、纖維細胞數(shù)，X為測得的OD值)。對方程進行統(tǒng)計檢驗顯示，該方程具有統(tǒng)計學意義。CCK-8比色法測得的OD值可以很好的反應實際細胞數(shù)量。丹參酮ⅡA干預的實驗組瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖活性受到不同程度的抑制，其中200ug/ml組抑制作用最為明顯，干預72小時、96小時、120小時后，OD值均數(shù)分別為0.41±0.10、0.60±0.27、0.70±0.27;而同期對照組0ug/ml組的OD值均數(shù)分別為0.56±0.02、0.97±0.01

16、、0.99±0.06，計算其增殖抑制率分別為100.00％、76.29％、71.72％。統(tǒng)計分析顯示，干預濃度對細胞活性的影響具有統(tǒng)計學意義(F=781.91，P＜0.001)，干預時間對細胞活性的影響具有統(tǒng)計學意義(F=1068.62，P＜0.001)，干預濃度和干預時間的交互作用對細胞活性的影響也有統(tǒng)計學意義(F=159.04，P＜0.001)。
　　 2.流式細胞術(shù)AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡顯示，丹

17、參酮ⅡA干預的實驗組瘢痕疙瘩成纖維細胞的早期凋亡率明顯增高，其中200ug/ml組早期凋亡率增高最為明顯，干預120小時后，早期凋亡率均數(shù)達41.62±1.84％，同期對照組0ug/ml組的早期凋亡率為3.68±0.76％，早期凋亡增加百分比達1030.98％。統(tǒng)計分析顯示干預濃度對早期凋亡率的影響具有統(tǒng)計學意義(F=654.17，P＜0.001)，干預時間對早期凋亡率的影響具有統(tǒng)計學意義(F=252.42，P＜0.001)，干預濃度和

18、干預時間的交互作用對早期凋亡率的影響也有統(tǒng)計學意義(F=91.91，P＜0.001)。
　　 3.流式細胞術(shù)PI法DNA染色檢測細胞細胞周期顯示，丹參酮ⅡA干預的實驗組瘢痕疙瘩成纖維細胞的G0/G1期比例均不同程度增加，其中200ug/ml組G0/G1期比例增加最為明顯，干預120小時后，G0/G1期均值為94.16±1.10％，同期對照組0ug/ml組的G0/G1期比例均數(shù)為75.13±1.53％，計算G0/G1期增加百分比達

19、25.33％。統(tǒng)計分析顯示，干預濃度對G0/G1期比例的影響具有統(tǒng)計學意義(F=60.31，P＜0.001)，干預時間對G0/G1期比例的影響具有統(tǒng)計學意義(F=24.44，P＜0.001)，干預濃度和干預時間的交互作用對G0/G1期比例的影響也有統(tǒng)計學意義(F=13.01，P＜0.001)。
　　 4.瘢痕疙瘩組織大體形念觀察發(fā)現(xiàn)，該動物模型未見排斥反應。實驗組和對照組連續(xù)干預14天后，實驗組瘢痕疙瘩組織塊大小為364.33±

20、50.17mm3，對照組瘢痕疙瘩組織塊大小為392.33±32.26mm3，兩獨立樣本t檢驗統(tǒng)計分析顯示，實驗組與對照組瘢痕疙瘩組織塊大小差異無統(tǒng)計學意義。
　　 5.HE染色及Masson三色法染色瘢痕疙瘩組織的組織形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)，該動物模型中瘢痕疙瘩組織塊移植后組織血供良好，無排斥反應，并能夠基本保持原有的組織學形態(tài)和生物學形態(tài)。實驗組與對照組瘢痕疙瘩組織塊的HE染色及Masson三色法染色的組織形態(tài)學表現(xiàn)未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。

21、
　　 6.Tunel法凋亡細胞染色發(fā)現(xiàn)，對照組瘢痕疙瘩組織塊的表皮部位能見到少量的凋亡細胞，瘢痕疙瘩組織塊內(nèi)部則極少發(fā)現(xiàn)凋亡細胞;而實驗組瘢痕疙瘩組織塊表皮及組織塊內(nèi)部均能可見大量凋亡細胞。
　　 五、結(jié)論
　　 丹參酮ⅡA可抑制體外培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖活性，誘導其凋亡，并阻滯細胞周期，且干預效果存在干預濃度依耐性及干預時間依耐性;保留表皮的瘢痕疙瘩組織塊植入裸鼠右側(cè)肩胛皮下的瘢痕疙瘩裸鼠模型，可以基本