軟骨細(xì)胞氧感應(yīng)機制及其調(diào)節(jié).pdf

1、本課題通過基因敲除技術(shù)，在體外研究HIF-1α對軟骨細(xì)胞氧感應(yīng)基因和細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)作用，并深入研究雌激素在低氧環(huán)境對軟骨細(xì)胞影響和可能對HIF-1α的調(diào)節(jié)作用。這將有利于闡明軟骨細(xì)胞氧感應(yīng)機制及關(guān)節(jié)病損發(fā)生機制，以探尋防治關(guān)節(jié)病損的新途徑。 第一部分：小鼠未成熟關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定和生物學(xué)性狀研究 目的：摸索一套小鼠未成熟關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離與培養(yǎng)方法，為關(guān)節(jié)疾患病理研究及細(xì)胞基因水平研究提供一條新途徑。

2、方法：通過酶消化分離獲得細(xì)胞。從細(xì)胞形態(tài)、功能等方面鑒定獲得的細(xì)胞是否具有典型的軟骨細(xì)胞表型。 結(jié)果：獲得的細(xì)胞表達Ⅱ型膠原和糖胺多糖。隨著傳代次數(shù)增加，Ⅱ型膠原和糖胺多糖表達下降，而Ⅰ型膠原表達增加。 結(jié)論：初步建立了小鼠未成熟關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定方法。盡管它可能與成熟關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有一定的差異，我們認(rèn)為小鼠未成熟關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞可以作為研究軟骨力學(xué)或病生理研究重要工具，以期達到尋找適合的基治療方法來阻止細(xì)胞外基質(zhì)降

3、解或通過基因工程修復(fù)軟骨病變。軟骨細(xì)胞隨著傳代次數(shù)增多易出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，因此以原代細(xì)胞為研究對象最佳。 第二部分：低氧對軟骨細(xì)胞影響 目的：研究低氧和低氧模擬化合物(氯化鈷)對軟骨細(xì)胞氧感應(yīng)基因和細(xì)胞表型影響。 方法：經(jīng)酶消化分離出軟骨細(xì)胞，分別在21％氧、2％氧和氯化鈷條件下培養(yǎng)一定時間。應(yīng)用定量-PCR和westernblot檢測GLUT-1，GLUT-3和PGK-1表達。應(yīng)用定量PCR觀察軟骨細(xì)胞表型改變。

4、用葡萄糖檢測試劑盒測葡萄糖攝取量。 結(jié)果：2％氧和氯化鈷增加GLUT1，3及PGK-1mRNA表達。2％氧和氯化鈷促進GLUT-1，GLUT-3和HIF-1α蛋白表達。低氧和氯化鈷促進細(xì)胞增殖，增加葡萄糖攝取。 結(jié)論：軟骨細(xì)胞能通過調(diào)節(jié)氧感應(yīng)基因適應(yīng)低氧環(huán)境。低氧能在一定程度上促進軟骨細(xì)胞增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成。模擬體內(nèi)氧環(huán)境培養(yǎng)細(xì)胞能更好地了解細(xì)胞特性第三部分低氧抑制無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡目的：研究低氧和低氧模擬化

5、合物能否抑制無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。 第三部分：低氧抑制無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡 目的：研究低氧和低氧模擬化合物能否抑制無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。 方法：細(xì)胞90％匯合后換無血清培養(yǎng)液，分別在21％氧、2％氧和氯化鈷條件下培養(yǎng)一定時間。應(yīng)用MTT檢測細(xì)胞活性。應(yīng)用透射電鏡、TUNEL、流式細(xì)胞儀方法檢測細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果：細(xì)胞形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)：細(xì)胞質(zhì)濃縮；出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象的空泡結(jié)構(gòu)；細(xì)胞核

6、染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)，常氧培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞有明顯的陽性細(xì)胞。流式細(xì)胞儀證實，低氧培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞凋亡率明顯低于常氧條件。 結(jié)論：低氧和氯化鈷抑制無血清培養(yǎng)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡。 第四部分：低氧誘導(dǎo)因子-1α調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成 目的：探討HIF-1α對氧感應(yīng)基因和細(xì)胞外基質(zhì)合成影響。 方法：利用Cre-loxp技術(shù)敲除軟骨細(xì)胞內(nèi)HIF-1α。將野生型和基因敲除

7、型細(xì)胞在21％氧和2％氧條件下培養(yǎng)。應(yīng)用定量PCR和westernblot檢測GLUT1，3及PGK-1表達。應(yīng)用定量PCR觀察軟骨細(xì)胞表型改變。用葡萄糖檢測試劑盒測葡萄糖攝取量。 結(jié)果：感染強度為100時，HIF-1α敲除率為72％。敲除HIF-1α基因后，低氧誘導(dǎo)的GLUT1，3及PGK-1表達增加消失，細(xì)胞外基質(zhì)合成減少，葡萄糖攝取也減少。 結(jié)論：HIF-1α是軟骨細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境并調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成的重要因子。

8、 第五部分：雌激素對低氧誘導(dǎo)因子-1α的調(diào)節(jié)和意義 目的：研究雌激素對HIF-1α及iNOS調(diào)節(jié)作用。 方法：細(xì)胞90％匯合后換無血清培養(yǎng)液(添加或不加雌激素)，在2％氧條件下培養(yǎng)。應(yīng)用定量PCR和westernblot檢測GLUT1，3及PGK-1，iNOS和HIF-1α表達。應(yīng)用定量PCR觀測軟骨細(xì)胞表型改變。 結(jié)果：低氧通過HIF-1α促進iNOS表達。生理濃度的雌激素抑制低氧誘導(dǎo)的HIF-1α和iN