狗脊多糖對(duì)軟骨細(xì)胞增殖及氧自由基影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在觀察狗脊多糖對(duì)體外培養(yǎng)大鼠軟骨細(xì)胞增殖和氧自由基的影響，為其在骨關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、本實(shí)驗(yàn)用水提醇沉、Sevag法除蛋白提取純化獲得狗脊多糖，通過(guò)苯酚-硫酸比色法測(cè)定狗脊多糖含量。
　　2、采用機(jī)械-酶消化法分離SD大鼠膝關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞，建立體外培養(yǎng)并鑒定軟骨細(xì)胞，使用倒置顯微鏡鏡下觀察軟骨細(xì)胞形態(tài);MTT法檢測(cè)狗脊多糖對(duì)軟骨細(xì)胞增殖特性的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

2、經(jīng)狗脊多糖干預(yù)的軟骨細(xì)胞周期變化的影響;RT-PCR、WesternBlot分別檢測(cè)軟骨細(xì)胞周期相關(guān)基因與蛋白的表達(dá);酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法分別檢測(cè)軟骨細(xì)胞液中SOD、NO、MDA的含量。
　　結(jié)果：
　　1、狗脊多糖含量為76.91％，精密度實(shí)驗(yàn)RSD=1.86％，表明儀器精密度良好，且穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD=1.98％，平均回收率試驗(yàn)為95.4％，RSD=1.83％。
　　2、第2代軟骨細(xì)胞形態(tài)一致、胞核可視且清晰，生長(zhǎng)狀態(tài)

3、良好;經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色鑒定其胞核為藍(lán)色;經(jīng)Ⅱ型膠原染色后，陽(yáng)性對(duì)照組胞漿區(qū)呈棕黃色。
　　3、MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，狗脊多糖對(duì)軟骨細(xì)胞增殖具有一定的時(shí)效-量效關(guān)系，其最佳干預(yù)時(shí)間和濃度分別為48 h和200μg/ml;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白組比較，各實(shí)驗(yàn)組(100;200;400μg/ml)干預(yù)48 h后，以200μg/ml組在G0/G1期所占細(xì)胞比例最低(P＜0.01)，在S期最高(P＜0.01); RT-PCR及Weste

4、rn Blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，各實(shí)驗(yàn)組(100;200;400μg/ml)干預(yù)48 h后，CDK4、Cyclin D1、pRB的mRNA與蛋白表達(dá)均高于空白組，且以200μg/ml組表達(dá)最顯著(P＜0.01)。
　　4、酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組SOD、NO、MDA含量表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，提示模型建立;與造模組相比，各實(shí)驗(yàn)組(100;200;400;800μg/ml)干預(yù)48 h，可上調(diào)SOD