HDAC4核內(nèi)穿梭在應(yīng)力調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　關(guān)節(jié)軟骨覆蓋在關(guān)節(jié)表面，是關(guān)節(jié)實(shí)現(xiàn)正常功能的重要結(jié)構(gòu)。關(guān)節(jié)軟骨的組成成分包括軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞外基質(zhì)主要包括膠原和蛋白多糖，而細(xì)胞成分只有軟骨細(xì)胞一種。軟骨細(xì)胞可分泌新基質(zhì)，并降解老化和受損的基質(zhì)，以維持軟骨結(jié)構(gòu)的完整性。負(fù)重是關(guān)節(jié)軟骨的基本功能，關(guān)節(jié)負(fù)重首先使關(guān)節(jié)軟骨受到直接的壓應(yīng)力。研究顯示力學(xué)應(yīng)力可調(diào)節(jié)軟骨的基因表達(dá)。正常生理應(yīng)力可促進(jìn)軟骨表型相關(guān)基因的表達(dá)和基質(zhì)蛋白分泌。相反，異常的機(jī)械應(yīng)力（如應(yīng)力過大

2、或喪失）可誘發(fā)或促進(jìn)軟骨的退變，軟骨退變最終會(huì)導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎。雖然大量研究都證實(shí)力學(xué)應(yīng)力和軟骨有密切的關(guān)系，但是力學(xué)傳導(dǎo)的機(jī)制，即軟骨細(xì)胞如何感應(yīng)和傳導(dǎo)力學(xué)信號，仍然不明了。組蛋白去乙?；?（HDAC4）特異性地分布在腦組織、心肌組織、骨骼肌肉和軟骨組織中。敲除HDAC4的基因鼠表現(xiàn)為軟骨細(xì)胞早期、異常的肥大，和異位骨化，最終在出生前后死亡。HDAC4有一奇特能力，可在細(xì)胞核和細(xì)胞漿之間穿梭。已有的研究顯示，HDAC4在細(xì)胞核內(nèi)外的穿梭

3、對肌肉細(xì)胞分化，神經(jīng)細(xì)胞功能的發(fā)揮起著重要的調(diào)節(jié)作用。我們實(shí)驗(yàn)室以往的研究顯示，HDAC4細(xì)胞核內(nèi)外的穿梭在生長板骺軟骨細(xì)胞的分化中起決定性的調(diào)節(jié)作用。但還不清楚，機(jī)械應(yīng)力是否能誘導(dǎo)HDAC4核內(nèi)外移動(dòng)。本研究旨在觀察壓應(yīng)力對HDAC4細(xì)胞核內(nèi)外移動(dòng)的影響，及HDAC4細(xì)胞核內(nèi)外的移動(dòng)在力學(xué)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)中的作用。
　　目的：
　　（1）應(yīng)用Flexcell? FX-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng)對體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加

4、壓應(yīng)力，觀察壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞內(nèi)HDAC4核內(nèi)外移動(dòng)的影響。
　?。?）應(yīng)用Flexcell? FX-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng)對體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加壓應(yīng)力，分析壓應(yīng)力引起的HDAC4核內(nèi)外移動(dòng)對軟骨細(xì)胞基因表達(dá)的影響，探討HDAC4核內(nèi)外移動(dòng)在壓應(yīng)力調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)中的作用。
　?。?）應(yīng)用Flexcell? FX-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng)和軟骨細(xì)胞體外立體培養(yǎng)，探討壓應(yīng)力誘導(dǎo)HDAC4核內(nèi)外移動(dòng)的機(jī)制，及HDAC4

5、核內(nèi)外移動(dòng)調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)的機(jī)制。
　　方法：
　　本課題包括以下五方面研究：
　?。?）軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)及壓應(yīng)力作用時(shí)間的選擇。包括以下幾方面內(nèi)容：
　　①6天齡幼鼠（C57Bl/6）軟骨細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)；
　　②綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的HDAC4（GFP-HDAC4）腺病毒載體的體外擴(kuò)增和轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的鼠軟骨細(xì)胞；
　?、蹖⑥D(zhuǎn)染GFP-HDAC4的軟骨細(xì)胞移至2％藻酸鹽水凝膠中，繼續(xù)立

6、體培養(yǎng)；
　?、軕?yīng)用Flexcell? FX-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng)，對體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加壓應(yīng)力，觀察不同作用時(shí)間對基因表達(dá)的影響，以選擇最佳的負(fù)載時(shí)間。
　?。?）觀察壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞內(nèi)HDAC4核內(nèi)外分布的影響。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：
　?、賾?yīng)用Flexcell? FX-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng)，對體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加最佳負(fù)載時(shí)間的壓應(yīng)力，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)HDAC4核內(nèi)外分布的變化；<

7、br>　?、趯κ芰筌浌羌?xì)胞的細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白進(jìn)行分離提取，應(yīng)用west-blot分析細(xì)胞漿內(nèi)HDAC4和細(xì)胞核內(nèi)HDAC4含量在壓應(yīng)力作用前后的變化。
　?。?）觀察壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞代謝、增殖及分化的影響。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容如下：
　?、賾?yīng)用RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞受到壓應(yīng)力后蛋白聚糖、II型膠原、LK1、SOX9、CDKN1A、X型膠原、MMP-13、Ihh和 Runx2基因表達(dá)的變化；
　?、趹?yīng)用Safranin

8、-O染色評價(jià)壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞分泌蛋白多糖的影響，應(yīng)用west-blot評價(jià)壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞分泌II型膠原的影響；
　　③應(yīng)用EdU細(xì)胞增殖檢測法評價(jià)應(yīng)力對軟骨細(xì)胞增殖的影響；
　?、苓M(jìn)一步行I型膠原和II型膠原免疫組織化學(xué)染色，評價(jià)應(yīng)力對軟骨細(xì)胞分化的作用。
　?。?）探討壓應(yīng)力誘導(dǎo)HDAC4細(xì)胞核內(nèi)外再分布的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容有：
　?、偈紫?，應(yīng)用免疫共沉淀和west-blot檢測壓應(yīng)力對軟骨細(xì)胞內(nèi)HDAC4磷酸化

9、的影響；
　?、谌缓?，應(yīng)用蛋白磷酸酶2A（PP2A）免疫沉淀磷酸酶檢測試劑盒觀察壓應(yīng)力對PP2A活性的影響。
　?。?）應(yīng)用PP2A抑制劑，岡田酸（Okadaic acid，OA），進(jìn)一步證實(shí)壓應(yīng)力促進(jìn)HDAC4細(xì)胞核內(nèi)外移動(dòng)是通過PP2A去磷酸化HDAC4途徑來調(diào)控的。
　　又分以下幾個(gè)實(shí)驗(yàn)：
　　①驗(yàn)證PP2A抑制劑，OA，阻止壓應(yīng)力誘導(dǎo)的HDAC4細(xì)胞核內(nèi)移。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)HDAC4核內(nèi)

10、外分布的變化，分離提取受力后軟骨細(xì)胞的細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，應(yīng)用west-blot分析細(xì)胞漿HDAC4和細(xì)胞核HDAC4含量在壓應(yīng)力作用后的變化；
　?、谧C實(shí)是否OA抑制壓應(yīng)力誘導(dǎo)的HDAC4去磷酸化。應(yīng)用HDAC4抗體對分離的軟骨細(xì)胞核、漿蛋白進(jìn)行免疫共沉淀，之后應(yīng)用抗磷酸化絲氨酸的抗體進(jìn)行west-blot檢測磷酸化的HDAC4。
　?、蹜?yīng)用PP2A免疫沉淀磷酸酶檢測試劑盒，檢測OA是否抑制PP2A活性；
　?、?/p>

11、應(yīng)用RT-PCR觀察OA是否抑制壓應(yīng)力誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞基因表達(dá)變化；
　　⑤應(yīng)用Hoechst33342/Propidium Iodide（PI）雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，觀察OA是否誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞死亡。
　　結(jié)果：
　?。?）軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)及壓應(yīng)力最佳作用時(shí)間。
　　①鼠軟骨細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)成功；
　　②含GFP-HDAC4腺病毒載體的體外擴(kuò)增成功，并可對體外培養(yǎng)鼠軟骨細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染；
　　③轉(zhuǎn)染GFP

12、-HDAC4的軟骨細(xì)胞在2%藻酸鹽水凝膠中立體培養(yǎng)生長良好，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，在2%藻酸鹽水凝膠中立體培養(yǎng)一周，軟骨細(xì)胞GFP-HDAC4的表達(dá)率約89.8%（86.9%～92.6%）；
　　④應(yīng)用Flexcell? FX-5000?壓應(yīng)力加載系統(tǒng)，對體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞施加壓應(yīng)力：0.5Hz正弦波形變化，0～20kPa壓應(yīng)力強(qiáng)度變化（0.5Hz，20kPa），施壓2小時(shí)和3小時(shí)時(shí)間點(diǎn)蛋白多糖和II型膠原的mRNA表達(dá)都

13、明顯增加（p<0.05），但施壓4小時(shí)后mRNA表達(dá)較3小時(shí)時(shí)間點(diǎn)減少（p<0.05），因此選擇3小時(shí)壓應(yīng)力（0.5Hz，20kPa）作為負(fù)載條件。
　?。?）壓應(yīng)力促進(jìn)HDAC4進(jìn)入軟骨細(xì)胞核。
　?、偌す夤簿劢癸@微鏡觀察顯示，在未受力的立體培養(yǎng)軟骨細(xì)胞中，HDAC4主要分布在細(xì)胞漿；而在受到3個(gè)小時(shí)壓應(yīng)力的軟骨細(xì)胞中，HDAC4主要分布在細(xì)胞核。比較HDAC4主要分布在細(xì)胞核內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，受應(yīng)力組明顯高于未受應(yīng)力組（P=0

14、.009）。
　?、诿庖吖渤恋韺?shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，細(xì)胞漿內(nèi)HDAC4蛋白含量，未受力組明顯高于受力組；而細(xì)胞核內(nèi)的HDAC4蛋白含量，受力組明顯高于未受力組。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)，壓應(yīng)力誘導(dǎo)HDAC4從細(xì)胞漿移動(dòng)到細(xì)胞核。
　?。?）壓應(yīng)力調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)。
　?、賀T-PCR檢測顯示，軟骨細(xì)胞受到壓應(yīng)力后蛋白聚糖、II型膠原、LK1和SOX9的mRNA表達(dá)顯著升高（p<0.05），而CDKN1A、X型膠原、MMP-13、Ih

15、h和 Runx2的mRNA表達(dá)顯著降低（p<0.05）；
　?、赟afranin-O染色顯示，壓應(yīng)力組軟骨細(xì)胞周圍的紅染程度比對照組顯著深；west-blot檢測顯示，壓應(yīng)力組的II型膠原蛋白量明顯高于對照組；
　?、跡dU檢測顯示，壓應(yīng)力組細(xì)胞的陽性率明顯高于對照組（P=0.0047）；
　?、苊庖呓M織化學(xué)染色顯示，壓應(yīng)力組細(xì)胞的II型膠原染色陽性，I型膠原染色陰性。以上結(jié)果證實(shí)壓應(yīng)力促進(jìn)軟骨細(xì)胞的代謝和增殖，并抑制

16、其分化。
　?。?）壓應(yīng)力使HDAC4去磷酸化，并增加PP2A活性。
　?、倜庖吖渤恋砗蛍est-blot檢測顯示，壓應(yīng)力可使軟骨細(xì)胞內(nèi)HDAC4去磷酸化；
　?、赑P2A免疫沉淀磷酸酶檢測顯示，壓應(yīng)力可增加PP2A活性。
　　（5）岡田酸（Okadaic acid，OA）抑制實(shí)驗(yàn)。
　?、貽A阻止壓應(yīng)力誘導(dǎo)的HDAC4細(xì)胞核內(nèi)移。激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，添加抑制劑OA后，軟骨細(xì)胞受到壓應(yīng)力，HDAC4仍

17、然主要分布在細(xì)胞漿。West-blot分析顯示，添加抑制劑OA后，軟骨細(xì)胞即使受到壓應(yīng)力，細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)的HDAC4含量與未受壓應(yīng)力的對照組相比變化也不明顯；
　　②免疫共沉淀和west-blot檢測證實(shí)，加抑制劑OA后壓應(yīng)力不能使HDAC4去磷酸化；
　?、跴P2A免疫沉淀磷酸酶檢測顯示，加OA后壓應(yīng)力不能增加PP2A活性；
　?、躌T-PCR檢測顯示，與壓應(yīng)力組比較，OA+壓應(yīng)力組中蛋白聚糖、II型膠原、LK1和

18、SOX9的mRNA表達(dá)顯著降低（p<0.05），而CDKN1A、X型膠原、MMP-13、Ihh和 Runx2的mRNA表達(dá)顯著增高（p<0.05）；
　　⑤應(yīng)用Hoechst33342/Propidium Iodide(PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒觀察顯示，OA不誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞死亡。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)：
　?、賶簯?yīng)力可促進(jìn)HDAC4由細(xì)胞漿進(jìn)入細(xì)胞核；
　　②HDAC4進(jìn)入細(xì)胞核后，可調(diào)節(jié)軟骨細(xì)