強(qiáng)的松與促皮質(zhì)素藥物致嬰幼期腦損傷的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、第一部分、治療劑量范圍內(nèi)強(qiáng)的松與ACTH大鼠用藥模型建立。 目的：建立在臨床治療劑量范圍內(nèi)強(qiáng)的松與ACTH的嬰幼大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?方法：將強(qiáng)的松或ACTH對(duì)HPA軸的影響程度作為劑量探索的原則。 ①?gòu)?qiáng)的松劑量的確認(rèn)：采集lO例臨床使用5天以上治療劑量強(qiáng)的松患兒清晨血清標(biāo)本，獲得用藥后平均皮質(zhì)醇血濃度。再以體表面積公式換算，將24只7日齡雄性SD嬰幼鼠分為：2mg/kg/d、3mg/kg/d和4mg/kg/d給藥組，

2、以及正常對(duì)照組(n=6)共4組。每日清晨8點(diǎn)一次性灌胃給藥，連續(xù)7日，第8日清晨8點(diǎn)麻醉后取血，測(cè)血清皮質(zhì)酮濃度。 ②ACTH劑量的確認(rèn)：60只14日齡雄性嬰幼鼠，根據(jù)給藥劑量和時(shí)間分為9個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組(n=6)。實(shí)驗(yàn)組麻醉后在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(2 pm，3 pm，3:30pm)，以大小相差40倍的3個(gè)劑量(3.8U/m2，38 U/m2，150 U/m2)分別腹腔注射ACTH一次；對(duì)照組僅麻醉不給予其他干預(yù)。4pm取血測(cè)皮質(zhì)酮

3、濃度。 結(jié)果： ①?gòu)?qiáng)的松劑量的確認(rèn)：10名患兒血清平均皮質(zhì)醇濃度為87.18±39.71 nmol/L，其均值為正常兒童均值(552nmol/L)的15.79％。 ②當(dāng)強(qiáng)的松劑量為4mg/kg/d時(shí)，大鼠皮質(zhì)酮濃度降低至對(duì)照組的15.17％，與臨床患兒皮質(zhì)醇抑制程度相一致。③在腹腔注射大小相差40倍的不同劑量ACTH后30分鐘時(shí)，嬰幼鼠皮質(zhì)酮水平均升高達(dá)到同一峰值，60分鐘時(shí)開(kāi)始下降，120分鐘時(shí)各劑量組皮質(zhì)酮水

4、平均回落至基礎(chǔ)值，與對(duì)照組無(wú)顯著差異。 結(jié)論： ①4mg/kg/d連續(xù)7日給藥后，嬰幼鼠血清皮質(zhì)酮濃度被抑制為正常的15％左右，與臨床測(cè)試相一致，因而被確認(rèn)為本研究強(qiáng)的松實(shí)驗(yàn)劑量。 ②與人類(lèi)研究相一致，注射ACTH30分鐘后，大鼠體內(nèi)皮質(zhì)酮增高程度不隨ACTH劑量變化而顯示差異。因而將臨床嬰兒痙攣治療劑量按照體表面積直接換算，構(gòu)建與臨床治療劑量匹配的ACTH實(shí)驗(yàn)大鼠模型。 第二部分、強(qiáng)的松與ACTH致嬰幼

5、期腦損傷的組織學(xué)研究。 目的：以健康大鼠為對(duì)照，觀察不同療程和劑量的強(qiáng)的松與ACTH對(duì)生后早期嬰幼鼠腦發(fā)育的組織病理學(xué)影響。 方法：7日齡嬰幼期和2月齡成年健康SD雄性大鼠各192只，分別給予：(1)強(qiáng)的松組：兩年齡組各96只，分為治療劑量組(4mg/kg/d)、小劑量組(2mg/kg/d)和對(duì)照組(賦形劑0.5％CMC)，清晨一次灌胃給藥； (2)ACTH組：同樣分為治療劑量組(150U/m2/d)、小劑量組(38U/

6、m2/d)和對(duì)照組(生理鹽水)，每日劑量分兩次腹腔注射給藥。每一劑量組(n=32)又分為長(zhǎng)療程組(3周)(n=16)和短療程組(10天)(n=16)。分別在完成預(yù)定療程后次日清晨(n=8)和停藥4周后(n=8)留取標(biāo)本，記錄體重、腦重，測(cè)血清皮質(zhì)酮濃度，對(duì)額葉皮層及海馬切片行HE及尼氏染色，透射電鏡觀察海馬超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果： ①嬰幼鼠短程治療劑量強(qiáng)的松組血清皮質(zhì)酮抑制程度為對(duì)照組的10.75％，短程治療劑量ACTH組血清

7、皮質(zhì)酮升高程度為對(duì)照組的1.83倍，與第一部分的劑量預(yù)測(cè)基本一致，表明模型建立成功。 ②短程強(qiáng)的松或ACTH均導(dǎo)致嬰幼鼠及成年鼠體重顯著降低，與對(duì)照相比降低幅度在7.9～17.5％間，劑量愈大降低愈明顯。停藥4周后，兩年齡組的體重有不同程度恢復(fù)，但仍低于對(duì)照。長(zhǎng)程給藥對(duì)體重的抑制更為明顯，對(duì)嬰幼鼠體重的抑制程度達(dá)20.6～37.7％。停藥4周后，兩年齡鼠體重均值仍較對(duì)照低9.8～23.5％。 ③嬰幼鼠用藥后發(fā)生明顯腦重下

8、降。短程用藥后兩藥致嬰幼鼠腦重降低的幅度在5.3～10.7％間，降低幅度與劑量相關(guān)。停藥4周后強(qiáng)的松組己基本恢復(fù)正常，唯ACTH組腦重仍較對(duì)照組減低近20％。長(zhǎng)程用藥后嬰幼鼠強(qiáng)的松組抑制幅度與短程相似，ACTH組抑制幅度高達(dá)11.7～15.9％。長(zhǎng)程給藥對(duì)成年鼠腦重也有輕度影響，抑制幅度2.2％～4.8％間。停藥4周后，成年鼠腦重與對(duì)照不再有差距，但嬰幼鼠兩藥治療劑量組腦重仍較對(duì)照分別減低4.1％和13.2％(P＜0.01)。

9、④HE染色發(fā)現(xiàn)，兩藥短程治療劑量與長(zhǎng)程兩劑量的嬰幼鼠，以及長(zhǎng)程治療劑量成年鼠均可見(jiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞變性及壞死，停藥4周后均未再見(jiàn)明顯組織學(xué)病變。 ⑤尼氏染色發(fā)現(xiàn)，嬰幼鼠在兩藥物的短程和長(zhǎng)程治療劑量，以及長(zhǎng)程小劑量給藥時(shí)，均可見(jiàn)額葉皮層及海馬神經(jīng)細(xì)胞尼氏體減少、溶解消失現(xiàn)象，額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)較對(duì)照組明顯減少，分別達(dá)25.9％～32.1％(強(qiáng)的松)和24.4％～29.1％(ACTH)間。停藥4周后，神經(jīng)細(xì)胞病變不再明顯，但無(wú)論短程

10、或長(zhǎng)程用藥，治療劑量ACTH嬰幼鼠神經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)仍低于同齡對(duì)照15.8％～20.3％。無(wú)論短程或長(zhǎng)程用藥，兩藥均未引起成年鼠額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量的明顯異常，但在長(zhǎng)程治療劑量時(shí)可見(jiàn)海馬神經(jīng)細(xì)胞有尼氏體減少、溶解消失現(xiàn)象，停藥4周后，病變不再明顯。 ⑥透射電鏡發(fā)現(xiàn)病變海馬神經(jīng)細(xì)胞染色質(zhì)邊集，濃縮成塊狀，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線(xiàn)粒體腫脹，血管周?chē)[。并見(jiàn)髓鞘溶解變性及分層現(xiàn)象。停藥4周后超微結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常。 結(jié)論： ①?gòu)?qiáng)

11、的松與ACTH均會(huì)引起嬰幼鼠和成年鼠體重明顯降低。 ②強(qiáng)的松與.ACTH對(duì)嬰幼鼠和成年鼠腦組織均有損傷作用，但嬰幼鼠更敏感。停藥4周后，額葉皮層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量仍然減少，表明激素，尤其ACTH對(duì)嬰幼鼠腦組織可能造成持久性損傷。 ③強(qiáng)的松與ACTH對(duì)細(xì)胞數(shù)量的減少與腦重的降低并不平行，提示腦重的降低不僅由細(xì)胞數(shù)量減少引起，還可能涉及其他機(jī)制的作用。 目的：初步探討強(qiáng)的松與ACTH導(dǎo)致腦損傷的機(jī)理。 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)

12、物及分組同第二部分。ELISA檢測(cè)血清NSE，免疫組化檢測(cè)額葉和海馬皮層Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)，TUNEL檢測(cè)凋亡神經(jīng)細(xì)胞。 結(jié)果： ①?gòu)?qiáng)的松或ACTH在治療劑量下短程或長(zhǎng)程給予均可致嬰幼鼠血清NSE顯著增高，短程組分別增高50.62％與57.34％(P＜0.05或P＜0.01)，長(zhǎng)程組分別增高103.23％與100.04％(P＜0.01)；成年鼠僅在兩藥治療劑量下長(zhǎng)程給藥時(shí)方顯著增高，分別為66.81％和60.40

13、％(P＜0.05)。停藥4周后，各組NSE較對(duì)照組已無(wú)顯著差異。 ②短程或長(zhǎng)程給予兩藥的嬰幼或成年各組額葉及海馬皮層Bc1-2蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。 ③短程給藥時(shí)Bax蛋白表達(dá)僅在兩藥治療劑量嬰幼組有顯著增高(P＜0.01)，Bax/Bc1-2比值亦升高為對(duì)照組的1.91～2.29倍，而成年鼠則無(wú)顯著增高。兩藥長(zhǎng)程治療劑量和小劑量均致嬰幼組Bax蛋白在額葉和海馬皮層表達(dá)顯著增高，Bax/Bc1-2比值達(dá)對(duì)照組

14、的1.92～2.70倍，而成年鼠僅治療劑量下在海馬皮層有增高。停藥4周后各組Bax以及Bax/Bc1-2比值均恢復(fù)至對(duì)照組水平。 ④兩藥短程治療劑量、長(zhǎng)程兩劑量嬰幼組的額葉及海馬皮層，長(zhǎng)程治療劑量成年組的海馬皮層，均較對(duì)照組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增多，停藥4周后均消失。 結(jié)論： ①除過(guò)度凋亡外，以海馬為主的神經(jīng)細(xì)胞壞死也是強(qiáng)的松與ACTH導(dǎo)致嬰幼腦損傷的主要機(jī)制。 ②Bax蛋白表達(dá)和Bax/Bc1-2