大鼠新型閉合性顱腦損傷模型的實驗研究.pdf

1、研究背景 長期以來，顱腦損傷的研究受到學者們的廣泛關注，他們從不同角度對顱腦損傷的發(fā)生原因、生物力學機制、病理生理學、病理形態(tài)學及分子病理學變化等方面進行了廣泛而深人的研究。實驗動物模型的建立一直是認識和研究顱腦損傷病理機制與臨床救治的一個重要組成部分。建立一個既能反映人類顱腦損傷的特點，又便于進行觀察和施加處理因素的致傷模型，是我們長期以來尋求的主要目標之一。通過各種致傷模型，可以模擬顱腦損傷的發(fā)生過程，研究顱腦損傷原發(fā)損傷

2、和繼發(fā)損害的機制。 根據(jù)顱腦解剖結構的破壞情況，可將損傷動物模型分為開放性和閉合性TBI兩大類。閉合性顱腦損傷模型按其致傷方式和機制的不同，大致可分為落體撞擊法、液壓沖擊法、加速負荷致傷法、控制性皮層挫傷等幾種類型。 自由落體TBI模型是以不同高度不同重量的重錘以自由落體方式撞擊，造成不同程度的閉合性TBI，它類似臨床上的閉合性顱腦加速傷。但是該模型不易準確控制打擊強度，難以制作精細分級的動物腦損傷模型，同時致傷過程中實

3、驗動物死亡率較高。液壓致傷模型是在保持硬腦膜完整前提下，實驗動物顱骨開窗，通過向一密閉顱腔內快速注入一定量的生理鹽水，造成腦組織的變形和移位導致TBI。該模型受外來因素干擾小，不受顱骨個體差異影響，重復性好。致傷力定量準確，可復制出不同程度顱腦損傷模型。然而該裝置致傷機制與人類受傷機制不盡一致，因而不適用于顱腦損傷的生物力學的研究。該模型制作復雜，由于手術和麻醉的干擾，術后不容易觀察到真實腦損傷CNS癥狀。旋轉模型是將動物頭部固定后，將

4、頭顱瞬間旋轉引起腦內產生剪切應力，從而導致彌漫性TBI。此類裝置，能夠單一施加旋轉加速度致傷，在實驗中較好地模擬了彌漫性軸索損傷(DAI)的病理改變。力學參數(shù)可調控，有利于生物力學分析。然而所施加的載荷和臨床實際致傷暴力不一致，而且儀器比較復雜，成本比較高，推廣不易。 雖然彌漫性軸索損傷DAI是臨床閉合性顱腦損傷的重要形態(tài)學特征，但是采用以往的模型制作方法如液壓沖擊法、控制性皮層沖擊法卻少有成功建立的大鼠DAI模型。因此我們需要

5、繼續(xù)探索使用鼠類制作彌漫性軸索損傷的有效方法。 第一部分大鼠新型閉合性顱腦損傷模型的建立及其評估 本研究的第一個目的就是制造出可控制的大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷模型的致傷裝置，然后利用此裝置建立評價損傷程度的參數(shù)。在建立參數(shù)之后，制造大鼠閉合性彌漫性TBI動物模型。通過觀察大鼠致傷后的早期神經(jīng)反射、病理生理學改變、組織學改變、腦水腫及血腦屏障改變、血清NO及ET-1變化、腦微循環(huán)灌注量改變等幾方面，評估建立的輕型閉合性彌漫性TBI

6、模型的有效性。 實驗一彈簧式生物打擊裝置的研制與應用 目的 為了彌補前述動物致傷裝置的缺陷，自行設計和研制一套可控制的小型生物致傷裝置，為顱腦損傷的動物實驗研究提供實驗設備。 方法 采用彈簧驅動鋼棍，以不同角度標示不同打擊力度，建立大鼠腦損傷動物模型，觀察傷后大鼠存活情況、病理改變及神經(jīng)行為變化。 結果 利用可調控的該裝置對大鼠進行實驗，不同致傷條件下可造成動物頭部的不同程度的

7、創(chuàng)傷。 結論 本裝置具有操作方便、定量可控、重復性好等優(yōu)點，可以成功便地制作出所需的大鼠顱腦損傷模型，是較理想的致傷裝置。 實驗二 大鼠新型閉合性顱腦損傷模型的建立及其評估 目的 為了評估自制的新型致傷模型的有效性及傷后腦的改變是否符合實驗要求。 材料與方法 取220只大鼠隨機分成七組。 第一組20只，損傷及對照各10只，觀察損傷后表現(xiàn)及早期神經(jīng)反射檢查。 第二組2

8、0只，損傷及對照各10只，病理生理學觀察 第三組20只，損傷10只及對照10只，作激光多普勒腦微循環(huán)測量 第四組40只，損傷35只及對照5只，做形態(tài)學觀察(HE染色、髓鞘染色、銀染、掃描電鏡觀察及透射電鏡觀察) 第五組40只，損傷35只及對照5只，作腦水腫測量 第六組40只，損傷35只及對照5只，作血腦屏障測量 第七組40只，損傷35只及對照5只，作N0，ET檢測 結果 1．損傷組

9、大鼠平均昏迷30分鐘。本實驗中大鼠致傷后立即出現(xiàn)短暫呼吸停止，3分鐘后恢復自主呼吸，15分鐘后呼吸與損傷前頻率、幅度一致。大鼠傷后出現(xiàn)一過性心率加快。損傷后血壓立即上升，稍候逐漸下降，1分鐘后血壓下降到最低，以后逐漸恢復，至30分鐘后恢復到損傷前水平。 2．模型組大鼠在受傷后5分鐘腦血流PU(perfusion unit， PU)值較對照組降低31％，至30min降至最低，約為正常對照組的57％，1小時后PU值逐步回升，但至2

10、小時，PU值仍然較對照組低。 3．顯微鏡下可以觀察到損傷組大鼠腦干、小腦、額極和海馬等部位神經(jīng)細胞有不同程度損傷的改變，傷后3小時可見彌漫性軸索損傷表現(xiàn)。髓鞘染色顯示損傷后大鼠均有不同程度的DAI改變，嗜銀染色6h可見較為明顯的收縮球形成，12h可見典型軸索收縮球。掃描電鏡下全腦彌漫的神經(jīng)纖維軸索腫脹、排列紊亂、扭曲或呈波浪狀變形、斷裂，髓鞘不規(guī)則脫落或呈套袖樣剝離。透射電鏡下可見軸索髓鞘出現(xiàn)分離、腫脹、內折，有髓纖維節(jié)段性膨大

11、，髓鞘板層松散，呈洋蔥樣變或空泡樣變。 4．傷后15min，大鼠腦皮質、海馬含水量開始升高，傷后1h含水量顯著增高，傷后1d達高峰。 5．致傷后15min，大鼠腦皮質、海馬組織的伊文思藍含量明顯升高，6小時達高峰后逐漸下降。 6．損傷后30min，大鼠血漿ET開始升高，3小時明顯升高，6小時達到高峰后逐漸下降，24小時含量下降，但仍然高于對照組。大鼠損傷后15min血漿NO開始下降，1小時下降至最低后逐漸上升，至

12、24小時達到高峰。 結論 我們成功建立了一種新型閉合性彌漫性TBI動物模型。本模型所致顱腦損傷與臨床加速性顱腦損傷機制類似，成功地復制出顱腦損傷的多個重要臨床特征。該模型所導致的病理生理改變、病理形態(tài)學改變、血清學改變、腦水腫及血腦屏障改變、腦局部血流改變等與以往報導的彌漫性軸索損傷動物模型一致。我們制作的模型操作簡單、重復性強，適合于閉合性TBI后的相關研究。 本研究的第二個目的是在我們建立的輕型閉合性彌漫性顱

13、腦損傷模型的基礎上，觀察大鼠顱腦損傷后不同頻率刺激下腦干聽覺誘發(fā)電位(BAEP)的波峰潛伏期(peak latency，PL)、波峰間潛伏期(interpeak latency，IPL)、波峰潛伏期比值(peak latencyratio，PL Ratio)的變化，探討不同頻率刺激下BAEP對顱腦損傷的診斷價值。同時對其MTBI后BAEP與腦組織損傷的動態(tài)變化進行觀察，探討B(tài)AEP在閉合性顱腦損傷后聽覺功能障礙評估的價值，為臨床實踐及法

14、醫(yī)臨床學鑒定提供實驗依據(jù)。 目的 觀察大鼠顱腦損傷后不同頻率刺激下腦干聽覺誘發(fā)電位(BAEP)的變化，為顱腦損傷的早期臨床診斷和法醫(yī)學活體傷害鑒定提供實驗依據(jù)。 方法 使用自制彈簧式小型生物打擊機打擊大鼠顱頂部，制造閉合性彌漫性顱腦損傷模型。分別于傷后6h、12h、2d、4d以10Hz低刺激率、50Hz高刺激率記錄大鼠腦干聽覺誘發(fā)電位，將各組結果進行比較。 結果 TBI后50 Hz高刺激率BAEP的第2d、4d組

15、V波PL和6h、12h、2d、4d組III—V波IPL，較對照組延長(P<0.05)。各組之間10Hz低刺激率BAEP差異無顯著性意義(P>0.05)。各組10Hz、50Hz刺激率BAEP PL比值中ⅢⅡ／Ⅰ、Ⅳ／Ⅱ、V／Ⅱ、Ⅳ／Ⅲ、V／Ⅲ比值無明顯損傷后改變。 結論 高刺激率BAEP測試是早期診斷顱腦損傷的可靠方法，其敏感性優(yōu)于低刺激率BAEP測試。 實驗二閉合性顱腦損傷后大鼠BAEP及腦損傷的動態(tài)變化 目的

16、 觀察大鼠閉合性彌漫性顱腦損傷后腦干聽覺誘發(fā)電位(brainstem auditory evoked potential，BAEP)的動態(tài)改變及腦組織病理學變化，探討B(tài)AEP在顱腦損傷后評估聽覺功能障礙的價值。 方法 使用自制彈簧式小型生物打擊機打擊大鼠顱頂部，制造閉合性彌漫性輕型顱腦損傷模型。120只雄性SD大鼠隨機分成對照組和實驗組，實驗組又分別劃分為病理組及BAEP檢測組。在光鏡下觀察對照組及傷后15min、1h、3h、

17、6h、12h、ld、2d、4d、7d、10d、14d、21d等時間點大鼠腦組織病理學改變，干-濕法檢測腦組織含水量。分別于傷前、傷后各時間點以50Hz刺激率記錄大鼠BAEP，將各組結果進行比較。 結果 損傷后15min，50 Hz刺激率BAEP的Ⅰ-Ⅴ、Ⅲ—Ⅴ IPL即較損傷前延長(p<0.05)，至6h-12h，Ⅲ、Ⅴ PL較損傷前延長。損傷后1d一2d，Ⅲ、Ⅴ PL和Ⅰ-Ⅲ、Ⅰ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅴ IPL均較損傷前顯著延長(P<0