內皮素1在體外對喉癌HEP2細胞影響的實驗研究.pdf

1、內皮素家族有三種異構體：內皮素1、內皮素2、內皮素3，其中內皮素l的生物學活性最為多樣，研究也最充分?，F(xiàn)已明確內皮素1是含21個氨基酸的活性肽，與G蛋白偶聯(lián)受體A或者受體B受體結合后，可激活不同的信息通路，最終可發(fā)揮其生物學效應。研究表明，內皮素1的生物學效應非常復雜，對氣道張力、離子運輸、神經傳遞、垂體功能、基因調控等均發(fā)揮影響。 最近又發(fā)現(xiàn)內皮素1對多種惡性腫瘤的病理發(fā)展同樣具有調控作用。國外多項研究證實，惡性腫瘤組織或者培

2、養(yǎng)的腫瘤細胞存在內皮素1或者受體的表達；在內皮素受體的介導下，內皮素1可以通過促進細胞增殖、抑制凋亡、促進血管生成、促進細胞周圍侵潤及遠處轉移等多種方式，促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。 喉癌是頭頸部腫瘤中的高發(fā)疾病，占頭頸部腫瘤的13.9％，我國部分地區(qū)發(fā)病率約為1.5-3.4/10萬人，已成為嚴重威脅人民生命健康和生活質量的疾病。相對于其它惡性腫瘤，內皮素1與喉癌病理發(fā)展之間關系的研究并不充分，國外僅Shichiri等初步研究發(fā)現(xiàn)內皮

3、素1可以促進喉癌細胞數(shù)量的增長，但惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞增殖、調亡、移行能力等密切相關，在喉癌病理發(fā)展過程中，內皮素1在上述方面的具體作用仍然缺乏深入了解，這正是本課題擬予解決的。 目的: 1．明確內皮素1、內皮素受體在喉癌細胞中表達情況。 2．了解內皮素1對喉癌細胞增殖的影響。 3．了解內皮素1對喉癌細胞移行能力的影響。 4．了解內皮素1對喉癌細胞凋亡的影響。 方法: 1．RT

4、 PCR方法檢測內皮素1、內皮素受體A、內皮素受體B在人喉癌HEP 2細胞的基因表達；通過免疫組化ABC法研究內皮素1、內皮素受體A、內皮素受體B在人喉癌HEP 2細胞爬片的蛋白表達。 2.細胞種植于96孔板(2×10<'3>細胞/孔)，5個濃度的內皮素1(1×10<'-7>mol/L，1×10<'-8>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-10>mol/L、1×10<'-11>mol/L)分別處理人喉癌HEP

5、 2細胞，MTT方法檢測24小時、48小時、72小時、96小時的吸光度，觀察內皮素1能否促進細胞增殖。 3．按300個細胞/孔密度，將HEP2細胞接種于24孔板，3個濃度內皮素1(1×10<'-7>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-11>mol/L)干預細胞48小時后，繼續(xù)培養(yǎng)10天，觀察克隆生成情況。 4．按3×10<'5>細胞/孔密度，將HEP 2細胞接種于6孔板，3個濃度內皮素1(1×10<'

6、-7>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-11>mol/L)分別處理細胞48小時，采用劃痕實驗方法觀察內皮素1對喉癌細胞移行能力的影響。 5. 3個濃度內皮素1(1×10<'-7>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-11>mol/L)分別處理細胞24、48小時后，觀察喉癌細胞凋亡指數(shù)的變化。 結果: 1．人喉癌HEP 2細胞采用內皮素1、內皮素受體A、內皮素受體B和GAPD

7、H引物進行PCR，均獲得陽性目的片斷，與預期片斷長度符合。內皮素1擴增片斷長度為129bp，內皮素受體A擴增片斷長度為175bp，內皮素受體B擴增片斷長度為130 bp，GAPDH擴增片斷長度為141bp。 2．光學顯微鏡下觀察，人喉癌HEP 2細胞漿內見內皮素1棕黃色免疫反應顆粒沉著；內皮素受體A、內皮素受體B亦見免疫陽性反應，免疫反應主要分布于細胞膜。 3．MTT法顯示，1×10<'-7>mol/L,濃度內皮素1作用

8、喉癌HEP 2細胞后，可以明顯促進喉癌HEP 2細胞增殖，而1×10<'-11>～1×10<'-8>mol/L濃度組的內皮素1對喉癌細胞HEP 2的增殖沒有作用。 4．內皮素1干預喉癌HEP 2細胞48小時，并繼續(xù)培養(yǎng)十天后，內皮素1(1×10<'-7>mol/L濃度)處理組細胞集落體積大，細胞克隆數(shù)為59.0±2.00；1×10<'-9>mol/L濃度組克隆數(shù)為32.6±1.15，1×10<'-11>mol/L濃度組克隆數(shù)為3

9、0.6±2.08，對照組為31.0±1.00。內皮素1(1×10<'-7>mol/L濃度)組與對照組比較，有顯著性差異。 5．1×10<'-7>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-11>mol/L濃度內皮素1處理細胞48小時后，明顯促進喉癌HEP 2細胞的移行，其中對照組移行細胞數(shù)為8.00±1.00，內皮素1各處理組(1×10<'-7>mol/L、1×10<'-9>mol/L、1×10<'-11>mol/L

10、)分別為21.6±1.57、17.3±1.52、15.6±2.08，與對照組比較，各個內皮素1濃度組均有顯著性差異。 6．流式檢測顯示，內皮素1處理24、48小時后，各內皮素1濃度組與對照組、各內皮素1濃度組間細胞凋亡率(AI)均無顯著性差異。 結論: 1．人喉癌HEP 2細胞存在內皮素1、內皮素受體A和內皮素受體B基因及蛋白表達。 2．內皮素1可以促進人喉癌HEP 2細胞增殖，并且與內皮素1的濃度高低相