E1A基因?qū)戆〩ep-2細(xì)胞生長(zhǎng)及放射敏感性的影響及其初步機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討E1A基因?qū)戆〩ep-2細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和放射敏感性的影響及其初步機(jī)制。 方法： 1.將Ad-ElA和Ad-β-gal在293細(xì)胞中擴(kuò)增后提取、純化并滴定，再將其轉(zhuǎn)染至喉癌Hep-2細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR鑒定,G418篩選獲得含E1A的陽(yáng)性克隆。轉(zhuǎn)染后將Hep-2細(xì)胞分為未轉(zhuǎn)染組(PBS組)、轉(zhuǎn)染空載體組(Ad-β-gal)和轉(zhuǎn)染E1A組(Ad-E1A組)。 2.通過胎盼蘭拒染細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)及MTT法繪制

2、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并計(jì)算倍增時(shí)間。 3.通過克隆形成實(shí)驗(yàn)繪制細(xì)胞存活曲線并計(jì)算Do、Dq、α和β值以觀察E1A基因?qū)戆┘?xì)胞放射敏感性的影響。 4.通過流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡及RT-PCR測(cè)VEGF的水平并半定量以初步探討其初步機(jī)制。 結(jié)果： ①RT-PCR結(jié)果說明：E1A已整合到采用Ad-E1A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因組中并且穩(wěn)定表達(dá)。 ②轉(zhuǎn)染E1A基因的喉癌細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，倍增時(shí)間延長(zhǎng)，分別是未轉(zhuǎn)染組(PBS組)

3、、轉(zhuǎn)染空載體組(Ad-β-gal)的1.72倍和1.70倍。 ③流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染E1A的細(xì)胞出現(xiàn)S期降低和G2/M期阻滯。 ④轉(zhuǎn)染E1A基因的喉癌細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染組(PBS組)、轉(zhuǎn)染空載體組(Ad-β-gal)放射線照射敏感性增強(qiáng)，Do分別為0.861Gy、1.96Gy、1.98Gy(P<0.005)，Dq分別為1.02Gy、1.97Gy、1.99Gy(P<0.005)，α分別為0.536、0.104、0.112和p

4、分別為0.521、0.137、0.125。 ⑤流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示：PBS組、Ad-β-gal組、Ad-E1A組、PBS組+放射組、Ad-β-gal組+放射組、Ad-E1A組+放射組的細(xì)胞凋亡率分別為1.26％、1.18％、2.16％、2.55％、2.96％、4.96％。 ⑥Ad-ElA組、PBS組+放射組、Ad-β-gal組+放射組及Ad-ElA組+放射組VEGF的表達(dá)水平較PBS組及Ad-β-gal組低，且Ad-ElA