抑制myostatin蛋白的作用促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的成肌分化及其移植治療mdx鼠的研究.pdf

1、Duchenne型肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)是一種X連鎖隱性遺傳病，以進行性四肢近端骨骼肌萎縮無力、小腿腓腸肌假性肥大為特征，是最常見的神經(jīng)肌肉疾病?；颊叨嘤?0歲左右死于呼吸衰竭和/或心力衰竭。其病因是由于X染色體的抗肌萎縮蛋白基因突變，導(dǎo)致其編碼的基因產(chǎn)物抗肌萎縮蛋白(dystrophin，DYS)缺乏。 目前對DMD仍無有效的治療辦法，研究主要集中在藥物治療、基因治療和細

2、胞治療。藥物治療只能作用于DMD病理生理的特定環(huán)節(jié)，暫時緩解但無法阻止病情進展?；蛑委熓窍虬屑毎胝Ｓ泄δ艿幕蛞约m正或補償致病基因所產(chǎn)生的缺陷，從而達到治療目的，但也存在表達效率低、分布局限、載體容量不足以攜帶全長DYS基因、具有生物毒性等缺陷而致應(yīng)用困難。DMD細胞治療包括成肌細胞和干細胞移植治療，成肌細胞移植采用局部注射，治療部位局限，不能治療心肌與膈肌損害，且dystrophin表達時間短，這些問題阻礙了成肌細胞移植的臨床

3、應(yīng)用；干細胞因攜帶人體正常的基因組，具有成肌分化潛能，是細胞移植治療DMD較為理想的選擇。 骨髓干細胞移植被認為是目前較有前途的治療方法。研究認為骨髓中的造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)和間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stemcells，MSCs)都具有分化為肌細胞的潛能，其中MSCs由于取材方便、來源豐富、容易培養(yǎng)、分化能力強而日益成為干細胞研究的熱點。MSCs具有多向分化潛能包

4、括可以向肌細胞分化已經(jīng)十分明確，但是其在體外、體內(nèi)向肌細胞分化的效率都還不高，而其中關(guān)鍵性的因素是什么并不清楚，也一直是廣大學(xué)者十分關(guān)心而未能解決的問題。對于DMD患者來講，主要病理損害在骨骼肌組織，所以提高MSCs移植后向骨骼肌分化的效率及參與骨骼肌功能修復(fù)的能力是必須的。上述問題的解決對于MSCs移植治療DMD具有重要的臨床指導(dǎo)意義。 Myostatin(growth determining factor-8，GDF-8)是

5、最近才鑒定的轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)/發(fā)育生長因子超家族的一個新成員，它是一個結(jié)構(gòu)高度保守，影響肌肉發(fā)育和生長的關(guān)鍵性負性調(diào)節(jié)因子，研究證明它的負性成肌調(diào)節(jié)作用主要是通過抑制肌前體細胞的增殖和分化，使這些細胞不能向骨骼肌轉(zhuǎn)化，最終影響骨骼肌的發(fā)育和生長，而抑制myostatin的作用通路或基因突變所致myostatin的缺失，都可導(dǎo)致動物和人的骨骼肌異常增生和肥大。MSCs在體外誘導(dǎo)成肌的過程中是否有myostatin的表達?而抑制

6、或阻斷它表達后的作用通路能否提高MSCs向肌細胞轉(zhuǎn)化的比例?而在用MSCs移植治療mdx鼠時，如果用特異性抗體中和體內(nèi)產(chǎn)生的myostatin后，能否使移植的MSCs更多向骨骼肌分化并表達多量的dystrophin蛋白?以及它們的機制是什么?這些正是本研究所關(guān)心和要解決的問題。 本研究擬將培養(yǎng)的MSCs首先在體外用5-氮胞苷進行成肌分化誘導(dǎo)，檢測myostatin的表達，并用抗體中和產(chǎn)生的myostatin后，檢測MSCs體外成

7、肌分化的效率；然后在用MSCs移植治療mdx鼠時，用抗體中和mdx鼠體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性myostatin后，觀察MSCs在骨骼肌融合的比例和新生dystrophin的表達，從而為MSCs移植和阻斷myostatin的作用結(jié)合起來治療DMD提供理論基礎(chǔ)。 材料和方法: 1.實驗材料 1.1試驗動物 3-4周齡的SD雄性大鼠15只作為供體鼠，用于MSCs的分離和培養(yǎng)，進行體外實驗和細胞移植。7-9周：mdx鼠3

8、6只，12只為未治療組的陰性對照，12只為單純MSCs移植的實驗對照組，12只為myostmin抗體處理的實驗組。分別于移植后1周、4周、16周取材，保持各組、各時間點動物為4只。 1.2實驗試劑與器材(略) 2.實驗方法 2.1 MSCs的分離培養(yǎng)和鑒定 應(yīng)用DMEM培養(yǎng)SD大鼠骨髓干細胞，差速貼壁法分離、擴增及純化MSCs，并進行表面抗原鑒定，將形態(tài)一致的P5代MSCs用于體外實驗和移植。 2

9、.2 體外誘導(dǎo)MSCs成肌分化時myostatin的免疫熒光、RT-PCR、Western Blot檢測 將P5代MSCs按1×10<'5>/孔接種至6孔板，細胞生長至60-70﹪融合時，實驗組按終濃度10 μmol/L加入5-氮胞苷誘導(dǎo)分化24小時后，改為含2﹪HS的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天、7天、14天，相應(yīng)對照組不給與5-氮胞苷。于不同時間點做免疫熒光、RT-PCR和Western Blot，檢測實驗組和對照組細胞m

10、yostatin的表達。 2.3 抗myostatin抗體在體外對MSCs誘導(dǎo)成肌分化的影響 經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)分化后的MSCs，其中實驗組加入終濃度分別為2gg/ml、8gg/ml、16μg/ml的抗myostatin抗體，相應(yīng)對照組不給與myostatin抗體，繼續(xù)培養(yǎng)3天、7天、14天。取處理后3天的細胞用于MyoD、7天后的細胞用于myogenin、14天后的細胞用于MHC檢測，分別做免疫熒光、RT-PCR、Wes

11、tert Blot。 2.4 Mdx鼠移植前后的處理方案 在細胞移植前3天，對實驗的mdx鼠進行γ射線照射(7.0y劑量)。實驗組于移植前1天腹腔注射抗myostatin抗體(6mg/kg)，以后每周一次，對照組則給予等量0.01 M PBS。 2.5 MSCs的標記和移植 取生長良好的p5代細胞，于移植前48小時、以終濃度為10μmol/L的BrdU摻入培養(yǎng)細胞中，尾靜脈注射入標記的MSCs，移植細胞數(shù)

12、量為1.2X10<'7>/只。 2.6 MSCs移植后在mdx鼠體內(nèi)各器官的致瘤、致畸型觀察 BrdU標記的MSCs移植入mdx鼠后在相應(yīng)時間點剖析各器官，觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)有無異常，有無腫瘤或者畸形的發(fā)生。 2.7 MSCs移植后16周肌酸激酶(CK)的測定 移植后分別取各組mdx鼠外周血1.2ml，取血清約250ul，用CK-NAC檢測CK值。 2.8 移植后16周mdx鼠肌肉組織HE染色

13、 分別取各組mdx鼠腓腸肌的冰凍切片進行常規(guī)HE染色，在鏡下觀察細胞形態(tài)，×400倍取8個視野，計數(shù)肌核中心移位纖維數(shù)目，并計算其比例。 2.9 移植后1周腓腸肌BrdU與Myod的免疫熒光雙標檢測 取移植后各組mdx鼠的腓腸肌進行冰凍切片做免疫熒光雙標染色，檢測Myod的表達情況及陽性核的來源。 2.10 移植后8周腓腸肌BrdU與myogenin的免疫熒光雙標檢測 取移植后各組mdx鼠的腓腸肌進行冰凍

14、切片做免疫熒光雙標染色，檢測myogenin的表達情況及陽性核的來源。 2.11 移植后16周腓腸肌BrdU與MHC的免疫熒光雙標檢測 取移植后各組mdx鼠的腓腸肌進行冰凍切片做免疫熒光雙標染色，檢測MHC的表達情況及陽性纖維的來源。 2.12 移植后16周腓腸肌DYS的免疫熒光、RT-PCR、Western Blot檢測 取移植后各組mdx鼠的腓腸肌進行免疫熒光雙標染色、RT-PCR和Westemblo

15、t，檢測dystrophin的表達情況及陽性纖維的來源。 2.13 統(tǒng)計學(xué)分析 所有統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0進行檢驗分析，有意義水平為P<0.05。 結(jié)論: 1.在體外實驗中證實，。MSCs在用5.氮胞苷誘導(dǎo)成肌分化時，于不同階段都可表達大量的myostatin，通過其分泌作用抑制了MSCs向成熟肌管的進一步分化。 2.應(yīng)用myostatin單克隆抗體在有效中和MSCs誘導(dǎo)分化時產(chǎn)生的my

16、ostatin后，抑制其負性成肌調(diào)節(jié)作用，可明顯促進MSCs在體外向肌細胞的分化。 3.在用MSCs尾靜脈移植治療mdx鼠時，應(yīng)用myostatin單克隆抗體中和mdx鼠體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性myostatin后，在增加骨骼肌體積的同時，可以提高MSCs移植后在體內(nèi)向骨骼肌細胞分化的成功率，并表達dystrophin蛋白。 4.在用myostatin抗體處理mdx后，沒有觀察到除骨骼肌外的其它組織器官的異常改變，說明此方法是安