Decorin(DCN)促進(jìn)大鼠ADSCs的成肌分化及其移植治療mdx鼠的研究.pdf

1、Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy,DMD)是一種常見的X染色體連鎖隱性遺傳病，最早由法國(guó)神經(jīng)病學(xué)家Duchenne de Boulogne于1868年描述，后人為了紀(jì)念他將該病命名為DMD，Gowers更詳細(xì)地描述了該病，為了紀(jì)念他，將DMD的典型表現(xiàn)命名為Gowers征。DMD發(fā)病率約為，每3500個(gè)男嬰中有一個(gè)患該病，女性攜帶者的攜帶頻率為1/2300，是最常見的遺傳性神經(jīng)肌肉疾

2、病之一。該病的主要特征是：進(jìn)行性的四肢近端骨骼肌萎縮并且無(wú)力，小腿腓腸肌假性肥大，并且及心肌和呼吸肌也有嚴(yán)重病變，心衰和呼吸衰竭常常是致死原因。
　　 目前對(duì)DMD仍無(wú)有效的治療辦法，研究主要集中在藥物治療、基因治療和細(xì)胞治療。藥物治療只能作用于DMD病理生理的特定環(huán)節(jié)，暫時(shí)緩解但無(wú)法阻止病情進(jìn)展?；蛑委熓窍虬屑?xì)胞引入正常有功能的基因以糾正或補(bǔ)償致病基因所產(chǎn)生的缺陷，從而達(dá)到治療目的，但也存在表達(dá)效率低、分布局限、載體容量不足

3、以攜帶全長(zhǎng)dystrophin基因、具有生物毒性等缺陷而致應(yīng)用困難。DMD細(xì)胞治療包括成肌細(xì)胞和干細(xì)胞移植治療，成肌細(xì)胞移植采用局部注射，治療部位局限，不能治療心肌與膈肌損害，且dystrophin表達(dá)時(shí)間短，這些問(wèn)題阻礙了成肌細(xì)胞移植的臨床應(yīng)用；干細(xì)胞因攜帶人體正常的基因組，具有成肌分化潛能，是細(xì)胞移植治療DMD較為理想的選擇。
　　 目的：將decorin轉(zhuǎn)染給ADSCs，將細(xì)胞治療和抑制myostatin相結(jié)合，體內(nèi)外觀察

4、decorin抑制myostatin后的成肌率變化并研究其機(jī)制，并檢測(cè)肌酶，肌力以及肌肉病理的變化，從而為ADSCs移植和抑制myostatin的作用結(jié)合起來(lái)治療DMD提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 ⑴7只雌性SD大鼠(4-6 week)用來(lái)進(jìn)行ADSCs的培養(yǎng).在體內(nèi)試驗(yàn)，我們選用了34只mdx鼠(8-9 week)，隨機(jī)分成3組：(1)未治療組(mdx組)：經(jīng)放療但未治療的mdx小鼠10只(2)GFP-ADSCs

5、細(xì)胞移植治療組(GFP-ADSCs組)：7-9周鼠齡的mdx鼠(12只)進(jìn)行GFP-ADSCs細(xì)胞尾靜脈移植(3)DCN-ADSCs細(xì)胞移植治療組(DCN-ADSCs組)：7-9周鼠齡的mdx鼠(12只)進(jìn)行DCN-ADSCs細(xì)胞尾靜脈移植。10只C57BL/C鼠做為對(duì)照。在細(xì)胞移植后20周，在運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)后處死動(dòng)物進(jìn)行HE染色，免疫熒光檢測(cè)，Western Blot檢測(cè)。
　　 ⑵應(yīng)用DMEM培養(yǎng)4-6周雌性SD大鼠脂肪干細(xì)胞

6、，按1×109/L密度接種于T-25培養(yǎng)瓶中，置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48小時(shí)后換液一次，棄去未貼壁細(xì)胞，以后每3～4天換液1次。
　　 ⑶用重組慢病毒液在不同條件下對(duì)ADSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率并探討其轉(zhuǎn)染的最佳條件。得出慢病毒轉(zhuǎn)染的最佳MOI(multiplicity ofinfection)。在最佳MOI值下，用含GFP的慢病毒和含GFP/DCN融合蛋白的慢病毒對(duì)ADSCs進(jìn)

7、行轉(zhuǎn)染，得到含GFP的ADSCs(以下簡(jiǎn)稱GFP-ADSCs或者GFP細(xì)胞)和含GFP和DCN融合蛋白的ADSCs(以下簡(jiǎn)稱DCN-ADSCs或者DCN細(xì)胞)。
　　 ⑷未轉(zhuǎn)染的大鼠ADSCs、GFP-ADSCs和DCN-ADSCs經(jīng)5-氮胞苷誘導(dǎo)分化24小時(shí)后，改為含5％HS的DMEM誘導(dǎo)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)3天、7天、14天。分別用免疫熒光和Western blot檢測(cè)各個(gè)時(shí)間段相對(duì)應(yīng)的MyoD、Myogenin和MHC的表達(dá)情況

8、。對(duì)以上細(xì)胞進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，16天后，光鏡和油紅O染色觀察成脂情況。
　　 ⑸比較移植前和移植后20周mdx鼠的體重。移植后20周，分別解剖不同組的鼠，比較不同組鼠的腓腸肌，股直肌及脛前肌的重量。
　　 ⑹各組實(shí)驗(yàn)鼠的腓腸肌組織整個(gè)取出，放入已經(jīng)用液氮冷凍的異戊烷3-5秒后，放入細(xì)胞凍存管后，浸入液氮中保存。OCT包埋，冰凍切片機(jī)切成5-6μm厚切片，做HE染色，鏡下觀察骨骼肌細(xì)胞的形態(tài)及變性壞死情況，肌纖維的粗細(xì)，核中心

9、移位纖維(centrally nucleated fiber，CNF)比例等情況。
　　 ⑺應(yīng)用SPSS13.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。資料的所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較用方差分析，多組間顯著性差異比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用Student-Neuls(S-N-K)檢驗(yàn)和LSD檢驗(yàn)。雙側(cè)檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。
　　 結(jié)果：
　　 ①大鼠ADSCs表面標(biāo)志抗原的表達(dá)：不表達(dá)成纖維細(xì)胞標(biāo)志物CD3

10、4，而表達(dá)整合素家族類抗原標(biāo)志分子CD29和黏附分子家族類抗原標(biāo)志分子CD44及CD13。
　　 ②ADSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后14天檢測(cè)可見橘紅色的鈣結(jié)節(jié)，為茜素紅S與鈣鹽形成的橘紅色復(fù)合物，對(duì)照組結(jié)果為陰性。
　　 ③ADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)16天后，檢測(cè)有脂肪形成，細(xì)胞中含大小不等的脂肪滴，細(xì)胞核被脂滴擠于細(xì)胞一側(cè)，對(duì)照組為陰性。
　　 ④MyoD是在成肌過(guò)程中早期表達(dá)的成肌因子。表達(dá)主要在細(xì)胞核。GFP

11、-ADSCs和DCN-ADSCs經(jīng)過(guò)5-氮胞苷誘導(dǎo)分化后3天，進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在GFP-ADSCs組中有平均9.8％的細(xì)胞胞核MyoD表達(dá)陽(yáng)性，呈明亮的紅色熒光，而DCN-ADSCs組，MyoD陽(yáng)性表達(dá)明顯增加，達(dá)到34.7％。Western Blot結(jié)果示：MyoD的表達(dá)在GFP-ADSCs組較少，而在DCN-ADSCs組其表達(dá)量明顯增加，與免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果基本一致。
　　 ⑤MHC是成肌晚期的標(biāo)志物，肌管中的特異

12、性標(biāo)志蛋白，表明肌管已經(jīng)完全分化成熟。主要表達(dá)于新生肌管的胞漿中。ADSCs經(jīng)過(guò)5-氮胞苷誘導(dǎo)分化14天后，進(jìn)行免疫熒光染色，陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿呈紅色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFP-ADSCs組中有平均4.2％的細(xì)胞胞核融合于MHC表達(dá)陽(yáng)性的肌纖維中，而在DCN-ADSCs組中，達(dá)到8.6％。Western Blot結(jié)果示MHC的表達(dá)在GFP-ADSCs組較少，而在DCN-ADSCs組表達(dá)量明顯增加，與免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果基本一致。
　　 ⑥Mdx

13、鼠由于肌膜缺乏dystrophin表達(dá)，肌細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)大量變性壞死，我們對(duì)移正常C57鼠、未治療mdx鼠及移植細(xì)胞后20周的各組mdx鼠的腓腸肌進(jìn)行冰凍切片。正常C57鼠的腓腸肌橫切面可以觀察到肌細(xì)胞得大小和形態(tài)基本一致，肌細(xì)胞呈典型的多邊形，未見明顯肌萎縮和壞死。肌細(xì)胞核位于肌膜附近，在肌纖維間隙，幾乎沒(méi)有觀察到CNF，肌細(xì)胞間質(zhì)未見炎細(xì)胞；肌纖維間隙正常，幾乎無(wú)纖維化，結(jié)構(gòu)完整。而在未治療的mdx鼠腓腸肌中，可見大量的炎細(xì)胞，肌細(xì)胞因

14、萎縮變成圓形，肌細(xì)胞間間隙變寬，細(xì)胞大小不均，可見有新生肌纖維，其形狀較小。CNF現(xiàn)象嚴(yán)重，細(xì)胞間隙可見明顯纖維化。GFP-ADSCs組20周后可見肌組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，細(xì)胞大小趨向統(tǒng)一，核中心移位現(xiàn)象減少，纖維化有所減輕。而DCN-ADSCs組mdx鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、核中心移位現(xiàn)象進(jìn)一步減少。另外DCN-ADSCs組mdx鼠肌纖維有增粗。
　　 ⑦對(duì)移植后20周的各個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行myostatin，decorin的wester

15、n blot的檢測(cè)。可見，在mdx鼠myostatin表達(dá)最多，GFP-ADSCs組mdx鼠的myostatin有所下降，DCN-ADSCs組mdx鼠下降最明顯。而decorin的表達(dá)正好相反，mdx鼠表達(dá)最小，GFP-ADSCs組mdx鼠的decorin表達(dá)有所上升，而DCN-ADSCs組mdx鼠上升最明顯。Myostatin和decorin的表達(dá)是完全相反的。
　　 ⑧應(yīng)用兔抗DYS抗體標(biāo)記的IgG進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)

16、，對(duì)照組C57鼠腓腸肌肌膜呈完整的網(wǎng)狀紅色熒光，mdx鼠肌膜基本未見紅色熒光；GFP-ADSCs組mdx鼠，20周后肌膜DYS陽(yáng)性纖維數(shù)大約占細(xì)胞總數(shù)的5.4％，部分肌膜DYS染色不連續(xù)，而在DCN-ADSCs組mdx鼠，DYS陽(yáng)性纖維數(shù)大約占細(xì)胞總數(shù)的7.9％。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴攜帶GFP和DCN的慢病毒載體可以有效轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs，并可以持久表達(dá)綠色熒光。
　　 ⑵用5-氮胞苷誘導(dǎo)ADSCs成肌分化時(shí)

17、，DCN-ADSCs成肌率較GFP-ADSCs高，而成脂率低，證明decorin可以抑制myostatin對(duì)細(xì)胞成肌的抑制作用，促進(jìn)ADSCs在體外向肌細(xì)胞的分化，同時(shí)抑制細(xì)胞向脂肪轉(zhuǎn)化。以上促進(jìn)成肌的作用可能是通過(guò)提高myoD和myogenin表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　 ⑶在用ADSCs尾靜脈移植治療mdx鼠時(shí)，decorin中和mdx鼠體內(nèi)產(chǎn)生的內(nèi)源性myostatin后，可以降低肌酶的水平，使肌肉明顯肥大，肌力提高。并且可以改善m