奶山羊硬脂酰輔酶A去飽和酶單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)既是乳中調(diào)控不飽和脂肪酸合成的限速酶，同時(shí)又是反芻動(dòng)物肉及乳中共軛亞油酸內(nèi)源合成的關(guān)鍵酶，能催化飽和脂肪酸發(fā)生去飽和反應(yīng)，對(duì)羊奶脂質(zhì)組成及代謝具有重要的調(diào)控作用，山羊特異性SCD抗體對(duì)該基因的脂肪酸調(diào)控功能研究等十分必要。
　　本研究旨在用原核表達(dá)純化后的SCD重組蛋白免疫小鼠，制備針對(duì)奶山羊(Capra hircus)SCD的單克隆抗體并進(jìn)行鑒定，明確該抗體的特性為研究SCD的功能提供了有效的工具。

2、通過(guò)生物信息學(xué)分析選取SCD基因目標(biāo)序列，采用PCR方法擴(kuò)增SCD基因，連接至pET32a(+)原核表達(dá)載體上，重組質(zhì)粒pET32a(+)-SCD在大腸桿菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá);使用組氨酸標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化融合蛋白，純化的SCD融合蛋白經(jīng)常規(guī)免疫法免疫4～6周齡的雌性Balb/c小鼠，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)檢測(cè)得到的免疫血清效價(jià);將脾細(xì)胞及SP2/0用促融劑融合制備雜交瘤克隆

3、，ELISA鑒定陽(yáng)性克隆孔，并進(jìn)行3次亞克隆;選用12周齡個(gè)體較大的小鼠注射鑒定結(jié)果為陽(yáng)性的雜交瘤克隆誘生腹水，純化腹水中單抗，再對(duì)純化后得到的SCD單抗進(jìn)行一系列生物學(xué)特性鑒定。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.PCR擴(kuò)增獲得了SCD N端210bp序列，成功構(gòu)建了pET32a(+)-SCD重組載體。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)，IPTG誘導(dǎo)后，成功生產(chǎn)得到了His-SCD目標(biāo)融合蛋白，大小為30kD。
　　2.重

4、組蛋白的最佳表達(dá)條件為:溫度25℃，IPTG1mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間12h。在此條件下，由Rosetta(DE3)上清中獲得了可溶的SCD重組蛋白，純度高，濃度為2.5mg/mL，滿足免疫需求。
　　3.用獲得的SCD重組蛋白當(dāng)作抗原注射小鼠，用PEG誘導(dǎo)發(fā)生成功免疫應(yīng)答的脾細(xì)胞與SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合，利用ELISA方法篩選陽(yáng)性雜交瘤克隆，經(jīng)過(guò)至少3次亞克隆得到了一株陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞系。
　　4.小鼠接種陽(yáng)性克隆細(xì)胞誘生