同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的抗凋亡及慢性應(yīng)激機(jī)理.pdf

1、一、同種異體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)及多向分化潛能鑒定 目的：探討同種異體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外的共培養(yǎng)，并行多向分化誘導(dǎo)鑒定。 方法：分別通過全骨髓直接培養(yǎng)法及密度梯度法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，各傳至第3代后，取等量細(xì)胞，混合后共培養(yǎng)，共培養(yǎng)之細(xì)胞再次傳代后，Wright—Gemsa染色后觀察其一般形態(tài)，以流式細(xì)胞儀行CD29、CD45、CD90表面標(biāo)志物鑒定，并分別進(jìn)行成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化，分別以

2、堿性磷酸酶、Von Cossa及油紅染色鑒定。 結(jié)果：全骨髓直接培養(yǎng)法原代細(xì)胞形態(tài)不均一，但是增殖能力好；密度梯度法分離得到的細(xì)胞較為均一，但增殖力不如全骨髓直接培養(yǎng)法；經(jīng)過3代傳代后，細(xì)胞均可獲得相對純化。共培養(yǎng)細(xì)胞增殖力較好，細(xì)胞形態(tài)較為均一，且未出現(xiàn)因免疫排斥導(dǎo)致的細(xì)胞死亡。Wright—Gemsa染色結(jié)果顯示共培養(yǎng)細(xì)胞呈典型梭形。流式細(xì)胞儀檢測顯示共培養(yǎng)細(xì)胞陽性表達(dá)CD29、CD90，陰性表達(dá)CD45。共培養(yǎng)之大鼠骨髓間

3、充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后分別出現(xiàn)成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)堿性磷酸酶、Von Cossa染色證實(shí)為成骨細(xì)胞，經(jīng)油紅染色證實(shí)為脂肪細(xì)胞。 結(jié)論：采用全骨髓直接培養(yǎng)及密度梯度離心法，經(jīng)3～5代培養(yǎng)后均可獲得相對純化之骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。同種異體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)生長良好，不發(fā)生免疫排斥，證實(shí)該類細(xì)胞的極低免疫原性。在體外，共培養(yǎng)之大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，表明其具有多向分化潛能。 二、同種異體大

4、鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)分化誘導(dǎo)鑒定 目的：探討同種異體大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外的共培養(yǎng)，并行神經(jīng)分化誘導(dǎo)鑒定。 方法：分別通過全骨髓直接培養(yǎng)法及密度梯度法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，各傳至第3代后，取等量細(xì)胞，混合后共培養(yǎng)，共培養(yǎng)之細(xì)胞再次傳代后，進(jìn)行神經(jīng)方向誘導(dǎo)，并行Nestin，NSE，GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。 結(jié)果：共培養(yǎng)之大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后出現(xiàn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，經(jīng)Nestin

5、，NSE，GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色證實(shí)為神經(jīng)細(xì)胞。 結(jié)論；同種異體共培養(yǎng)之骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可在體外定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，提示移植入體內(nèi)后，在適當(dāng)環(huán)境下可分化為神經(jīng)細(xì)胞。 三、脊髓損傷大鼠中同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)腦脊液向損傷區(qū)的遷移 目的:研究自脊髓損傷大鼠腰椎水平注射入蛛網(wǎng)膜下腔之同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)腦脊液向損傷區(qū)的遷移。 方法:分別通過全骨髓直接培養(yǎng)法及密度梯度法分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干

6、細(xì)胞，各傳至第3代后，取等量細(xì)胞，混合后共培養(yǎng)，共培養(yǎng)之細(xì)胞再次傳代后，以腺病毒轉(zhuǎn)染EGFP基因。取成年SD大鼠20只，隨機(jī)分為3組：對照組4只；模型組8只，治療組8只。模型組與治療組以改良Allen法復(fù)制大鼠下胸段脊髓損傷模型，對照組僅咬除相應(yīng)節(jié)段棘突及椎板，不干預(yù)脊髓。造模后7天，于腰椎水平（L4—L5間隙）蛛網(wǎng)膜下腔向?qū)φ战M及治療組注射經(jīng)EGFP標(biāo)記之BMSCs，模型組注射同體積的Hank's緩沖液。觀察各組動物造模前后及移植前后

7、后肢運(yùn)動功能，以BBB評分對其進(jìn)行評估，各組分別于移植后7天、14天隨機(jī)選取一半動物處死取損傷節(jié)段為中心脊髓，縱向切開脊髓后，一半行冰凍切片，于熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞向脊髓損傷區(qū)的遷移情況；另一半石蠟包埋后行HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察脊髓損傷區(qū)的細(xì)胞聚集情況。 結(jié)果:三組動物造模術(shù)前BBB評分均為21分（滿分）。術(shù)后第一天，對照組動物BBB評分恢復(fù)至21分。模型組和治療組動物造模術(shù)后第3、7天BBB評分均低于對照組，有極顯著

8、性差異（P<0.01），但兩組間比較無顯著性差異（P>0.05）。兩組動物自主排尿功能均在造模術(shù)后3天內(nèi)恢復(fù)。BMSCs以Ad5F35—EGFP腺病毒轉(zhuǎn)染后24h，熒光顯微鏡下即可見少量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。48h后，熒光顯微鏡下見大量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光。經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔注射EGFP標(biāo)記之BMSCs后，治療組動物從移植術(shù)后第1天開始，BBB評分持續(xù)增加。模型組動物BBB評分變化不大。移植術(shù)后第7天，模型組與治療組動物BBB評分分別恢復(fù)至6.00±

9、1.60和8.13±1.96分，與對照組相比均有極顯著性差異（P<0.01），且兩組間比較亦有顯著性差異（P<0.05）。熒光顯微鏡下觀察，EGFP標(biāo)記之BMSCs移植后7天、14天，對照組與治療組切片均見綠色熒光表達(dá)，模型組未見熒光表達(dá)。脊髓組織HE染色結(jié)果顯示：移植后7天、14天，對照組切片脊髓結(jié)構(gòu)正常；治療組切片脊髓損傷區(qū)可見空洞，在脊髓面向蛛網(wǎng)膜下腔一面見大量細(xì)胞聚集；模型組切片脊髓損傷區(qū)見較大空洞，未見明顯細(xì)胞聚集。

10、結(jié)論:由腰椎水平蛛網(wǎng)膜下腔注入之EGFP標(biāo)記BMSCs可經(jīng)腦脊液向大鼠下胸段脊髓損傷區(qū)遷移，并改善脊髓損傷大鼠后肢運(yùn)動功能。從臨床角度看，如采用BMSCs治療脊髓損傷，經(jīng)腰椎穿刺注射是一種更簡單、微創(chuàng)的術(shù)式。 四、同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對脊髓損傷大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 目的:探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的潛在抗凋亡機(jī)制。 方法:6周齡雄性SD大鼠8只，用于BMSCs分離培養(yǎng)。成年雄性SD大鼠

11、84只，根據(jù)移植術(shù)后取材時間點(diǎn)隨機(jī)分為6組，每組14只：A1.對照組，14天；A2.對照組，28天；B1.模型組，14天；B2.模型組，28天；C1.治療組，14天；C2.治療組，28天。模型組與治療組以改良Allen法復(fù)制大鼠下胸段脊髓損傷模型，對照組僅咬除相應(yīng)節(jié)段棘突及椎板，不干預(yù)脊髓。造模后7天，于腰椎水平（L4—L5間隙）蛛網(wǎng)膜下腔向?qū)φ战M及治療組注射BMSCs，模型組注射同體積的Hank's緩沖液。觀察各組動物造模前后及移植前

12、后后肢運(yùn)動功能，以BBB評分對其進(jìn)行評估。按組別分別于移植后第14天、第28天處死動物，其中每組8只以損傷節(jié)段或相應(yīng)節(jié)段為中心灌注后取脊髓組織，石蠟包埋后行HE染色，原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸（d—UTP）缺口末端標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）染色，Bcl—2、Bax免疫組織化學(xué)染色；5只以損傷節(jié)段或相應(yīng)節(jié)段為中心直接取脊髓組織，提取RNA后，行RT—PCR，檢測Bcl—2、Bax基因的表達(dá)；1只于損傷中心或相應(yīng)區(qū)域

13、直接取1mm×1mm×1mm脊髓組織塊，行透射電子顯微鏡觀察。 結(jié)果:三組動物造模術(shù)前BBB評分均為21分（滿分）。術(shù)后第一天，對照組動物BBB評分恢復(fù)至21分。模型組和治療組動物造模術(shù)后第3、7天BBB評分均低于對照組，有極顯著性差異（P<0.01），但兩組間比較無顯著性差異（P>0.05）。兩組動物自主排尿功能均在造模術(shù)后3天內(nèi)恢復(fù)。BMSCs移植后，治療組動物BBB評分持續(xù)增加，但仍低于對照組，有極顯著性差異（P<0.01

14、），模型組動物BBB評分變化不大。從移植術(shù)后第7天開始，治療組動物BBB評分均高于模型組，有極顯著性差異（P<0.01）。脊髓組織HE染色結(jié)果表明：移植后14天、28天，對照組切片脊髓結(jié)構(gòu)正常。模型組和治療組切片均可見脊髓損傷空洞，模型組更為明顯。透射電鏡觀察顯示，移植術(shù)后14天、28天，對照組凋亡細(xì)胞均較少，未見明顯壞死細(xì)胞。模型組可見大量凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞。治療組凋亡壞死細(xì)胞均較模型組少。移植后14天，模型組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)量多

15、于對照組和治療組，并有顯著性差異（P<0.01），陽性細(xì)胞主要分布于白質(zhì)中。治療組亦高于對照組，有顯著性差異（P<0.01）。 五、同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對脊髓損傷大鼠應(yīng)激狀態(tài)及中樞AMPA受體蛋白表達(dá)的影響 目的;探討同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對脊髓損傷大鼠應(yīng)激狀態(tài)及海馬和杏仁核AMPA受體蛋白表達(dá)的影響。 方法;成年雄性SD大鼠48只，根據(jù)移植術(shù)后取材時間點(diǎn)隨機(jī)分為6組，每組8只：A1.對照組，14天

16、；A2.對照組，28天；B1.模型組，14天；B2.模型組，28天；C1.治療組，14天；C2.治療組，28天。模型組與治療組以改良Allen法復(fù)制大鼠下胸段脊髓損傷模型，對照組僅咬除相應(yīng)節(jié)段棘突及椎板，不干預(yù)脊髓。造模后7天，于腰椎水平（L4—L5間隙）蛛網(wǎng)膜下腔向?qū)φ战M及治療組注射BMSCs，模型組注射同體積的Hank's緩沖液。觀察各組動物造模前后及移植前后后肢運(yùn)動功能，以BBB評分對其進(jìn)行評估，并記錄同時段動物體重。按組別分別于