轉(zhuǎn)基因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植修復(fù)成年大鼠脊髓損傷.pdf

1、本課題自大鼠骨髓分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，構(gòu)建了分別攜帶腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophicfactor，BDNF)及神經(jīng)營養(yǎng)素-3(neurotrophin-3，NT-3)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染MSCs，G418篩選獲穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株，之后移植修復(fù)成年大鼠脊髓完全橫斷傷。 主要研究結(jié)果有： 1．自成年大

2、鼠骨髓分離單個核細(xì)胞，經(jīng)連續(xù)傳代培養(yǎng)后，行克隆培養(yǎng)及成骨和成脂肪誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)克隆培養(yǎng)的上述細(xì)胞大多數(shù)可以形成典型的細(xì)胞克隆，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后有鈣結(jié)節(jié)沉積，經(jīng)成脂肪誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪滴，證實(shí)獲得骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞； 2．利用優(yōu)化的成神經(jīng)元誘導(dǎo)體系，誘導(dǎo)細(xì)胞獲得典型的神經(jīng)元樣外觀，維持培養(yǎng)1周后，70％以上的細(xì)胞呈現(xiàn)MAP-2(microtubuleassociated protein-2，微管相關(guān)蛋白-2)免疫反應(yīng)陽性；

3、 3．脊髓半橫斷后局部移植Hoechst標(biāo)記MSCs，2月后切片觀察，可見注射點(diǎn)周圍密集的Hoechst標(biāo)記細(xì)胞存活，細(xì)胞遷移主要沿脊髓縱軸方向、并跨過損傷區(qū)，遷移距離超過0.5cm，同時可見少量細(xì)胞沿水平方向遷移到注射點(diǎn)周圍遠(yuǎn)隔部位，免疫組化染色顯示少量(少于10％)存活細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物； 4．脊髓半橫斷后不同時間點(diǎn)，經(jīng)尾靜脈注射移植MSCs，發(fā)現(xiàn)在脊髓損傷后1月內(nèi)移植者移植細(xì)胞可在脊髓損傷部位明顯聚集并良

4、好存活，損傷5周時移植則局部細(xì)胞明顯減少，而6周時移植則基本觀察不到移植細(xì)胞的聚集現(xiàn)象，提示脊髓損傷后在一定時間窗內(nèi)經(jīng)血移植MSCs治療在理論上是成立的； 5．大鼠脊髓完全橫斷傷后局部微注射移植MSCs、BDINF轉(zhuǎn)染MSCs、NT-3轉(zhuǎn)染MSCs以及BDNF轉(zhuǎn)染MSCs+NT-3轉(zhuǎn)染MSCs，結(jié)果顯示單純MSCs移植可在一定程度上促進(jìn)神經(jīng)再生及運(yùn)動功能恢復(fù)，經(jīng)BDNF或NT-3基因修飾后可改善上述治療作用，而同時進(jìn)行BDNF、