鈣離子激活的鉀離子通道在人子宮內(nèi)膜蛋白水平的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、背景 鈣離子激活的鉀通道(KCa)是一類重要的鉀離子通道家族,他們能直接介導(dǎo)鈣離子信號(hào)的傳導(dǎo),改變膜電位,影響細(xì)胞的增殖分化.許多細(xì)胞都表達(dá)KCa,它的重要功能在于受到細(xì)胞內(nèi)第二信使鈣離子的影響,改變鉀離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),最終改變膜電位.目前根據(jù)他們不同生理、藥理特征,以及基因序列的差異,鑒定出三種KCa亞家族.KCa根據(jù)其電導(dǎo)的大小分為大電導(dǎo)KCa(Large-conductancecalcium-activated potass

2、ium channel BKCa); 中電導(dǎo)KCa(Intermediate-conductance calcium-activated potassium channel, IKCa)和小電導(dǎo)KCa(Small-conductance calcium-activated potassium channel,SKCa)三類.三種KCa通道都受到細(xì)胞內(nèi)鈣離子的調(diào)節(jié),但是它們分布在不同的組織,具有不同的功能.BKCa在血管血流的肌源性調(diào)節(jié)中

3、起著重要作用:IKCa在許多腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控中起著重要作用;SKCa在神經(jīng)系統(tǒng)有著豐富的表達(dá),調(diào)控大量神經(jīng)遞質(zhì)的釋放. 胚胎著床是人類生命形成和持續(xù)發(fā)育的最關(guān)鍵步驟,但到目前為止,胚胎著床的具體機(jī)制還不清楚,近年來有關(guān)通道蛋白在子宮內(nèi)膜中的作用及其與胚胎著床和生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系已逐漸成為生殖研究領(lǐng)域的新焦點(diǎn).目前包括Cl離子通道,Na<'+>離子通道,Ca<'+>離子通道及非離子通道的水通道(Aquaporins)在子宮內(nèi)膜中的表

4、達(dá),分布和功能的研究已在國(guó)內(nèi)外多家研究室深入展開.2003年NatureCell Biol發(fā)表論文闡明人纖維囊性病患者不孕是與子宮內(nèi)膜細(xì)胞C1<'->離子通道功能降低,導(dǎo)致HCO<,3><'->分泌減少相關(guān).2006年,首次報(bào)道新型通道蛋白-2型水通道(aquaporin 2)在人子宮內(nèi)膜細(xì)胞上表達(dá),并闡明了其分布特點(diǎn)及調(diào)節(jié)機(jī)制.我們知道鈣離子在多種細(xì)胞中都發(fā)揮的重要作用,包括子宮內(nèi)膜細(xì)胞,但是子宮國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(305707

5、89)內(nèi)膜細(xì)胞是否表達(dá)KCa至今未見任何報(bào)道. 本研究采用western blot方法檢測(cè)了BKCa、IKCa、SKCa(SK3)蛋白是否表達(dá)于人的子宮內(nèi)膜細(xì)胞,并分析比較三種通道蛋白在增生期和分泌中期的表達(dá)差異,推測(cè)三種通道在月經(jīng)周期中所起的作用;同時(shí)采用MTT方法,檢測(cè)分別在IKCa、SK3的特異性抑制劑的作用下,子宮內(nèi)膜的生長(zhǎng)狀態(tài),以了解這些通道對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖所起的作用. 材料與方法 1.選取管性不孕

6、擬接受體外受精一胚胎移植(IVF-ET)治療的婦女,于IVF-ET前一周期行宮腔探查時(shí)(體溫升高后第5-6天)取子宮內(nèi)膜作為分泌中期標(biāo)本(n=16);另取因子宮肌瘤行經(jīng)腹子宮次全切除(月經(jīng)周期第8-10d)子宮內(nèi)膜作為增生期內(nèi)膜(n=14),分別采用Western blot方法進(jìn)行膜蛋白BKCa、IKCa、SKCa (SK3)檢測(cè),對(duì)wes tern b10t結(jié)果進(jìn)行半定量分析. 2.我院因子宮肌瘤行經(jīng)腹子宮次全切除的婦女4例,

7、在離體子宮內(nèi)膜細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上,用MTT法測(cè)定在E<,2>、IKCa的抑制劑Tram-34和SKCa的抑制劑Apamin作用下,子宮內(nèi)膜其活性的變化.以未加藥組的子宮內(nèi)膜做對(duì)照,分別測(cè)定作用時(shí)間24h,48h,72h,96h后的OD值,繪制生長(zhǎng)曲線,選取加藥后96小時(shí)的OD平均值,進(jìn)行各組間數(shù)據(jù)比較分析. 采用單因素方差(One-Way ANOVA)、Tukey、t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行多組和兩組間數(shù)據(jù)比較分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05

8、,雙側(cè).所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSSl3.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理. 結(jié)果 1.BKCa、IKCa、SKCa(SK3)蛋白在人的子宮內(nèi)膜的增生期和分泌期均有表達(dá) 2.BKCa、IKCa、SKCa(SK3)蛋白在人的子宮內(nèi)膜的相對(duì)表達(dá)量BKCa在人的子宮內(nèi)膜增生期的相對(duì)表達(dá)量為0.43±0.05,分泌中期的相對(duì)表達(dá)量為1.24±0.12,樣本具有正態(tài)分布,方差齊同性,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),p<0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分泌

9、中期的表達(dá)明顯高于增生期;IKCa在人的子宮內(nèi)膜增生期的相對(duì)表達(dá)量為4.45±0.70,分泌中期的相對(duì)表達(dá)量為0.95±0.15,樣本具有正態(tài)分布,方差齊同性,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),p<0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,增生期的相對(duì)表達(dá)量明顯高于分泌中期;SKCa(SK3)在人的子宮內(nèi)膜增生期的相對(duì)表達(dá)量為4.80±0.76,分泌中期的相對(duì)表達(dá)量為0.98±0.25,樣本具有正態(tài)分布,方差齊同性,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),p<0.01,差異具有統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)意義,增生期的相對(duì)表達(dá)量明顯高于分泌中期. 3.IKCa的抑制劑Tram-34和SKCa(SK3)的抑制劑Apamin分別對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖的影響本研究所采用不同的藥物與子宮內(nèi)膜共培養(yǎng)24h,48h,72h,96h后對(duì)其活性分析,至加藥后72h,子宮內(nèi)膜細(xì)胞在抑制劑的作用下生長(zhǎng)減慢.E<,2>作用24h,48h,72h,96h后子宮內(nèi)膜細(xì)胞的吸光度OD值分別為:0.27±0.03,0.38±0.04,0.58±0.05,0.6

11、3±0.04;Tram-34作用24h,48h,72h,96h后子宮內(nèi)膜細(xì)胞的OD值分別為:0.26±0.01,0.33±0.4,0.34±0.04,0.34±0.04;Apamin作用24h,48h,72h,96h后子宮內(nèi)膜細(xì)胞的OD值分別為:0.26±0.02,0.32±0.03,0.38±0.04,0.45±0.03;對(duì)照組作用24h,48h,72h,96h后子宮內(nèi)膜細(xì)胞的OD值分別為:0.27±0.03,0.33±0.05,0.

12、40±0.05,0.49±0.03.對(duì)于加藥96h后各組0D值分別為對(duì)照組0.49±0.03,雌激素組0.63±0.04,lumol/LTram-34組0.34±0.04,lumol/L Apamin組0.45±0.03采用One-way ANOVA、tukey統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行各組間數(shù)據(jù)比較分析.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Tram-34組明顯低于對(duì)照組(p<0.05)和雌激素組(p<0.01),Apamin組明顯低于雌激素組(p<0.01),其它各組之間

13、無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異. 結(jié)論 1.KCa在人的子宮內(nèi)膜細(xì)胞上有周期性的表達(dá),是人子宮內(nèi)膜細(xì)胞的重要的離子通道之一. 2.BKCa在分泌中期的表達(dá)明顯高于增生期,推測(cè)BKCa可能參與雌孕激素誘導(dǎo)的人子宮內(nèi)膜細(xì)胞分泌中期相關(guān)因子的合成與釋放. 3.IKCa在增生期的表達(dá)明顯高于分泌中期,且IKCa的抑制劑Tram-34對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用,推測(cè)IKCa可能參與了子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖的調(diào)控.4.SKCa在增生