低分子柑橘果膠殺傷結(jié)腸癌細(xì)胞過(guò)程中關(guān)鍵凋亡蛋白的活化.pdf

1、背景：
　　 大腸癌是目前全球發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率有明顯的上升趨勢(shì)，在我國(guó)大腸癌的發(fā)病率也逐年上升，并且已經(jīng)成為我們城市人口癌癥死亡的第4位?；熓悄[瘤治療的重要組成部分，在過(guò)去的三十年內(nèi)，化療使腫瘤治療的效果得到了很大程度的提高。目前臨床上影響腫瘤化療效果進(jìn)一步提高存在兩個(gè)主要障礙，一是癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的的不敏感或是獲得性的耐藥；二是化療藥物對(duì)一些重要的組織和器官存在的非特異性的毒性，限制化療藥物有效劑量

2、的提高。
　　 由于化療導(dǎo)致的系統(tǒng)性毒性和藥物耐藥是腫瘤化療成功的主要障礙。而新的分子靶向藥物也存在價(jià)格昂貴和耐藥問(wèn)題，從食物中提取有效成分抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移活性并有可能增強(qiáng)化療藥物的研究越來(lái)越引起重視。研究發(fā)現(xiàn)低分子柑橘果膠（MCP）具有抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性，同時(shí)MCP作為一種天然的成分沒(méi)有明顯的毒副作用。
　　 我們的前期研究發(fā)現(xiàn)MCP不但對(duì)于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移灶的形成有抑制作用，而且對(duì)于原發(fā)灶也有一定的限制作用。MCP的抗

3、轉(zhuǎn)移活性已經(jīng)得到認(rèn)可，其抗轉(zhuǎn)移的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)理已證實(shí),但目前對(duì)于MCP抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制仍不清楚，已有報(bào)道MCP對(duì)黑色素瘤細(xì)胞具有一定的殺傷活性，與外源性的凋亡途徑有激活有關(guān)。因此我們推測(cè)MCP對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞也具有一定的殺傷活性。
　　 目的：
　　 研究低分子果膠（MCP）對(duì)結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的殺傷作用，并初步探討其分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞株；人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW116、HCT

4、116、HT-29、SW620、SW480。
　　 2、MTT法評(píng)價(jià)不同濃度MCP處理48小時(shí)對(duì)上述不同人結(jié)腸癌細(xì)胞株的體外抑制增殖的作用和明確MCP對(duì)上述實(shí)體瘤細(xì)胞的IC50值。
　　 3、顯微鏡觀察不同濃度MCP處理24小時(shí)后人結(jié)腸癌細(xì)胞形態(tài)的改變。
　　 4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)2.5mg/mlMCP對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞處理24小時(shí)后凋亡比例。
　　 5、Western blotting 檢測(cè)不同濃度MCP處理

5、抑制作用較強(qiáng)的細(xì)胞株48小時(shí)后
　　 Caspase-8，Caspase-9，Caspase-3，PARP蛋白表達(dá)水平的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、MCP對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株SW116、HCT116、HT-29、SW620、SW480均有抑制作用，且呈濃度依賴性，HCT116最敏感。因低分子柑橘果膠的溶解度問(wèn)題，高濃度無(wú)法溶解，故MTT實(shí)驗(yàn)無(wú)法順利完成，可幾乎完全溶解的濃度5mg/ml。
　　 2．顯微

6、鏡觀察濃度為2.5mg/mlMCP對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞株處理24小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，因?yàn)镸CP即使是低濃度溶解后液面仍較渾濁，所以無(wú)法觀察到細(xì)胞的形態(tài)，更無(wú)法觀察到細(xì)胞凋亡的特征。
　　 3．采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)濃度為2.5mg/ml的MCP作用于大腸癌SW116、HCT116、HT-29、SW620、SW480、細(xì)胞24小時(shí)后的凋亡細(xì)胞比例情況。發(fā)現(xiàn)MCP處理后凋亡細(xì)胞比例與空白對(duì)照組相比有顯著提高，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有顯著意義（P<0.

7、01）。
　　 4.應(yīng)用western Bloting方法檢測(cè)濃度為2.5mg/ml、5mg/mlMCP處理HCT116細(xì)胞48小時(shí)后，觀察caspaes-8、caspase-3、caspase-9、PARP酶原變化。兩種濃度下caspase-9、caspase-3酶原均有活化，可見(jiàn)裂解后的片段，PARP可見(jiàn)酶原裂解增加，caspase-8未出現(xiàn)明顯裂解片段。
　　 結(jié)論：
　　 1、MCP可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡