結(jié)直腸癌相關(guān)生物標(biāo)志物的臨床病理研究.pdf

1、研究目的: 研究生物標(biāo)志物P16、NF-кB/P65、FHIT、DNA-PKcs、Id2、EGFR及Her-2在結(jié)直腸癌的表達(dá)與腫瘤生物學(xué)特點(diǎn)并探討上述標(biāo)志物與患者無瘤生存時(shí)間和總體生存時(shí)間的關(guān)系。尋找新的與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)記物，以期為臨床提供更多的信息，指導(dǎo)治療，減少復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。 研究方法: 本實(shí)驗(yàn)為回顧性研究：復(fù)習(xí)解放軍總醫(yī)院病理科1993-2006年間根治性手術(shù)切除的結(jié)直腸癌558例，根據(jù)WHO結(jié)直

2、腸癌病理分類標(biāo)準(zhǔn)，查閱相關(guān)病歷，并對1993-2002年間結(jié)直腸癌手術(shù)患者共383例全部進(jìn)行隨訪，其中成功獲訪的病人共312例。將所得到的臨床資料與病理資料完整結(jié)合，最終選擇出資料完整的結(jié)直腸癌實(shí)驗(yàn)標(biāo)本共359例，其中有完整隨訪資料的共198例。 組織芯片的制作：在組織芯片技術(shù)原理的支持下，結(jié)合實(shí)際情況并采取重復(fù)性的探索，摸索出一個(gè)簡易可行的手工制作組織芯片的方法，并采用不銹鋼針及薄銅板自制了一個(gè)組織芯片打孔模具，將石蠟包埋的3

3、59例結(jié)直腸癌及35例癌旁正常組織標(biāo)本制作成7塊組織芯片。 免疫組化染色：采用PV6000二步法，檢測7塊組織芯片中359例結(jié)直腸癌及35例癌旁正常組織標(biāo)本的P16、NF-кd3/P65、FHIT、DNA-PKcs、Id2、EGFR及Her-2等七種生物標(biāo)志物表達(dá)狀況，分析其與臨床、病理及預(yù)后的關(guān)系。 EGFR基因突變的檢測：提取25例結(jié)直腸癌石蠟標(biāo)本的DNA，進(jìn)行定量測定，并采用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，用擴(kuò)增產(chǎn)物

4、來進(jìn)行純化及測序分析，觀察其EGFR基因第18、19、20及21外顯子的突變情況。Western印跡雜交：對16例新鮮結(jié)直腸癌手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行組織蛋白的提取及定量，并通過Western印跡雜交法比較結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織中DNA-PKcs蛋白表達(dá)的不同。結(jié)腸癌Colo205細(xì)胞的培養(yǎng)及熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色：采用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)結(jié)腸癌Colo205細(xì)胞，通過制備Colo205細(xì)胞懸液，經(jīng)Hoechst33342和PI染色、熒光免疫細(xì)胞化學(xué)

5、染色等實(shí)驗(yàn)方法，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)SP細(xì)胞，分析其在P16、NF-кB/P65、FHIT、DNA-PKcs及Id2中表達(dá)的異同。 結(jié)論: 1、NF-кB/P65、腹腔及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況以及術(shù)后是否采取放化療等輔助治療措施是結(jié)直腸癌無瘤生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因子；NF-кB/P65、TNM分期、腹腔及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況以及術(shù)后是否采取放化療等輔助治療措施是結(jié)直腸癌總體生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因子。 2、生物標(biāo)志物NF-кB/P6

6、5為陰性表達(dá)時(shí)，患者的無瘤生存時(shí)間較長，復(fù)發(fā)率較低。 3、DNA-PKcs、P16、NF-кB/P65、FHIT及Id2均與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展和(或)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，上述生物標(biāo)志物表達(dá)的變化可能對結(jié)直腸癌的演化和進(jìn)展起重要作用，并可能成為新的臨床輔助診斷和監(jiān)測預(yù)后的指標(biāo)。 4、DNA-PKcs、NF-кB/P65、EGFR及Id2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)明顯、高于癌旁正常組織，而FHIT則相反。P16和Her-2在癌和癌旁正