基于iTRAQ技術(shù)的結(jié)直腸癌蛋白標(biāo)志物鑒定.pdf

1、背景與目的:
　　 結(jié)直腸癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤疾病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)資料顯示，結(jié)直腸癌居男性常見(jiàn)惡性腫瘤發(fā)病率第三位，居女性常見(jiàn)惡性腫瘤發(fā)病率第二位，2008年度全世界估計(jì)總新增病例超過(guò)120萬(wàn)例，居第2位，死亡病例超過(guò)608，700人，居第4位。結(jié)直腸癌發(fā)病率具有明顯地域差異。其中高發(fā)地區(qū)為澳大利亞、新西蘭、歐洲和北美，非洲和中南亞為低發(fā)地區(qū)。世界范圍內(nèi)發(fā)病率男女之比約為1.16∶1。
　　

2、 隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高和改善，以及飲食習(xí)慣的變化，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率亦逐年升高，大中城市尤其明顯，資料表明，中國(guó)大陸13.4億人口，結(jié)直腸癌在全國(guó)腫瘤登記地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病率居第三位，發(fā)病39.7萬(wàn)例，發(fā)病率29.62/10萬(wàn)，居男性發(fā)病率第四位，女性發(fā)病率第三位;結(jié)直腸癌死亡率居第五位，死亡19.0萬(wàn)例，死亡率14.15/10萬(wàn)，居男性死亡率第五位，女性死亡率第四位。
　　 多項(xiàng)研究顯示，與結(jié)直腸癌發(fā)生相關(guān)的危

3、險(xiǎn)因素包括吸煙、缺乏體育鍛煉、超重及肥胖、紅色及加工處理的肉類(lèi)消費(fèi)和過(guò)度飲酒。結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)歷時(shí)數(shù)十年，多階段進(jìn)展，多因素參與，伴隨一系列的分子事件的復(fù)雜進(jìn)程。多年的研究揭示了大量的發(fā)生于DNA和RNA水平的分子特征性改變，形成了人們現(xiàn)在對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，包括了基因組DNA序列的突變，DNA拷貝數(shù)的改變，啟動(dòng)子超甲基化，miRNA表達(dá)水平改變等，最終這些變化影響了結(jié)直腸癌蛋白質(zhì)表達(dá)譜的改變。
　　 影響

4、結(jié)直腸癌預(yù)后的最重要因素就是早期診斷與早期治療，研究顯示TNMⅠ期患者的五年生存率可達(dá)90％以上，而有遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的Ⅳ期患者5年生存率只有大約10％。雖然經(jīng)過(guò)多年的基礎(chǔ)和臨床共同努力，結(jié)直腸癌死亡率和生存周期并未獲得明顯改善和延長(zhǎng)，究其原因，在于相當(dāng)一部分患者在就診時(shí)就已經(jīng)處于腫瘤進(jìn)展期。有報(bào)道表明，30-40％的就診患者已經(jīng)存在區(qū)域侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移性疾病，并無(wú)法通過(guò)單純的手術(shù)治療獲得治愈，并且超過(guò)一半的患者術(shù)后復(fù)發(fā)并且罹難于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

5、研究表明，通過(guò)對(duì)廣泛人群進(jìn)行篩查的結(jié)直腸癌早期檢測(cè)和診斷，以及對(duì)早期結(jié)直腸癌進(jìn)行干預(yù)，可以有效的延長(zhǎng)生存期，而這一切依賴于高效而準(zhǔn)確的結(jié)直腸癌診斷和預(yù)后生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用。
　　 蛋白質(zhì)參與了人類(lèi)生理、病理過(guò)程的絕大部分活動(dòng)，在疾病發(fā)生、機(jī)體反應(yīng)和康復(fù)的各個(gè)進(jìn)程都發(fā)揮著重要的作用，因此，作為生命活動(dòng)的重要作用分子形式，蛋白質(zhì)標(biāo)志物自然是生物標(biāo)志物篩選與鑒定的焦點(diǎn)。
　　 iTRAQ技術(shù)是由美國(guó)ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(

6、Applied BiosystemsIncorporation, ABI)開(kāi)發(fā)的同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tags forrelative and absolute quantitation，iTRAQ)的簡(jiǎn)稱，相對(duì)于傳統(tǒng)的定量鑒定，具有無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn):在同一實(shí)驗(yàn)中，最多可以對(duì)多達(dá)4到8種不同樣本進(jìn)行蛋白定量比較，可以對(duì)樣本中的絕大部分蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記，比如可以對(duì)磷酸化蛋白、糖基化蛋白等翻譯后修飾蛋白進(jìn)行定量、定性研

7、究，從中獲得更為詳盡的樣品信息，標(biāo)記過(guò)程更簡(jiǎn)便，在室溫條件下1小時(shí)即可完成，質(zhì)譜檢測(cè)更為靈敏。
　　 本課題研究采用的蛋白組學(xué)研究策略是以同位素相對(duì)絕對(duì)定量技術(shù)(iTRAQ)為基礎(chǔ)，通過(guò)聯(lián)合多維固/液相色譜技術(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分離和鑒定蛋白質(zhì)，對(duì)比結(jié)直腸癌與配對(duì)的正常對(duì)照粘膜組織蛋白質(zhì)組定量結(jié)果和同一患者術(shù)前與術(shù)后血清蛋白質(zhì)組定量結(jié)果，分別描繪結(jié)直腸癌患者組織對(duì)比和血清對(duì)比差異蛋白質(zhì)譜，通過(guò)比對(duì)組織和血清的差異蛋白質(zhì)譜，挑選一組在

8、組織和血清中均有一致性差異表達(dá)的差異蛋白，經(jīng)生物信息學(xué)分析后行Wester blot、免疫組化驗(yàn)證，篩選出一組具有理想診斷和/或預(yù)后價(jià)值或可作為治療靶點(diǎn)的免疫組織化學(xué)標(biāo)志物，以期提高結(jié)直腸癌疾病的早期診斷水平、改善患者預(yù)后和/或?yàn)橹委熖峁┛赡艿陌悬c(diǎn)。相比于以往的研究，本課題的創(chuàng)新性體現(xiàn)在在一次iTRAQ標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中同時(shí)比對(duì)同一患者的組織與血清差異表達(dá)蛋白譜，篩選在組織學(xué)和血清學(xué)水平具有一致性差異的蛋白標(biāo)志物，增強(qiáng)了后期驗(yàn)證結(jié)果的可靠性。<

9、br>　　 方法:
　　 本研究收集1例結(jié)直腸癌患者癌組織和配對(duì)正常粘膜組織，以及同一患者的術(shù)前和術(shù)后血清，經(jīng)蛋白提取和經(jīng)胰酶消化為多肽后，分別以同位素相對(duì)與絕對(duì)定量試劑盒(iTRAQ)標(biāo)記組織與血清蛋白肽段，將二者混合后經(jīng)過(guò)強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱(SCX)和反相色譜柱(RPLC)的二維分離，之后聯(lián)用MALDI質(zhì)譜技術(shù)對(duì)分離后的樣品蛋白質(zhì)多肽質(zhì)譜圖進(jìn)行定量鑒定，經(jīng)Mascot數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，描繪結(jié)直腸癌患者組織與血清差異蛋白質(zhì)譜。挑選出感

10、興趣的目的蛋白后，登錄GeneOntcology與Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行差異蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位和功能分析。
　　 經(jīng)生物信息學(xué)分析，挑選出差異表達(dá)蛋白標(biāo)志物，經(jīng)Western blot和免疫組織化學(xué)法驗(yàn)證其表達(dá)水平。收集除用于iTRAQ定量的結(jié)直腸癌病例以外的3例與之臨床病理特征匹配的結(jié)直腸癌病例，共4例的結(jié)直腸癌腫瘤組織及配對(duì)正常組織，經(jīng)前述冰凍組織保存及蛋白提取方法，進(jìn)行蛋白提取、定量后，分別取總蛋白各20μg進(jìn)

11、行Western blot驗(yàn)證，以PD QUEST軟件半定量分析。收集80例結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和匹配的正常對(duì)照粘膜組織，經(jīng)福爾馬林固定石蠟包埋處理后切片，經(jīng)逐步脫蠟至水、雙氧水(H2O2)封閉內(nèi)源酶活性、高溫高壓抗原修復(fù)、10％牛血清封閉、抗原特異性一抗過(guò)夜孵育、漂洗后種屬特異二抗常溫孵育、DAB顯色及蘇木素復(fù)染后，由兩位病理醫(yī)師分別對(duì)免疫組化(IHC)結(jié)果進(jìn)行雙盲評(píng)分。IHC評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):在5-10個(gè)隨機(jī)視野觀察200個(gè)上皮細(xì)胞，從免疫

12、陽(yáng)性染色細(xì)胞比例和免疫染色強(qiáng)度兩個(gè)方面進(jìn)行綜合評(píng)分，兩位醫(yī)師的評(píng)分平均后作為最終結(jié)果。根據(jù)免疫陽(yáng)性細(xì)胞比例不同，分為:0分，陰性;1分，＜10％陽(yáng)性;2分，11％-50％陽(yáng)性;3分，≥51％陽(yáng)性。根據(jù)免疫染色強(qiáng)度不同，分為:0分，陰性;1分，弱陽(yáng)性;2分，陽(yáng)性;3分，強(qiáng)陽(yáng)性。為系統(tǒng)評(píng)價(jià)蛋白標(biāo)志物Prenylcysteine oxidase1和Peroxiredoxin-4的診斷和/或預(yù)后價(jià)值。為評(píng)價(jià)篩選的蛋白標(biāo)志物的診斷可靠性，以免疫組

13、化評(píng)分為依據(jù)，從低到高設(shè)立7個(gè)診斷閾值，分別是評(píng)分≥0、1、2、3、4、5和6。統(tǒng)計(jì)分析在不同的診斷閾值下，蛋白標(biāo)志物用于結(jié)直腸癌(CRC)診斷的特異度、靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值與陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、約登指數(shù)(Youden Index)和一致性檢驗(yàn)Kappa值，繪制受試者工作特征曲線(ROC)，確定界值點(diǎn)，計(jì)算ROC曲線下面積AUC。
　　 結(jié)果:
　　 以同位素相對(duì)與絕對(duì)定量(iTRAQ)為基礎(chǔ)、固/液相二維分離及MALDI質(zhì)譜技術(shù)

14、描繪結(jié)直腸癌組織與血清差異蛋白譜，經(jīng)Scaffold篩選，NCBI human庫(kù)檢索，共鑒定到血清蛋白198個(gè)，其中差異蛋白102個(gè);腫瘤組織鑒定到蛋白568個(gè)，其中差異蛋白391個(gè)。經(jīng)過(guò)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，共有13個(gè)蛋白在血清和組織中都鑒定為差異表達(dá)蛋白，其中5個(gè)蛋白在腫瘤組織中表達(dá)水平上調(diào)，8個(gè)在腫瘤組織中表達(dá)水平下調(diào)，10個(gè)蛋白在術(shù)前血清中表達(dá)水平上調(diào)，3個(gè)蛋白在術(shù)后2周血清表達(dá)水平上調(diào)，4個(gè)蛋白表達(dá)差異具有一致性（我們規(guī)定，在腫瘤組織表達(dá)

15、升高/降低和在術(shù)前血清表達(dá)升高/降低，稱為表達(dá)差異具有一致性）。通過(guò)檢索UniProt knowledgebase數(shù)據(jù)庫(kù)(Swiss-Prot/TrEMBL，www.expasy.org)和GeneOntology(GO) Database數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)，我們對(duì)篩選出的13個(gè)差異蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能進(jìn)行了GO分析。GO分析結(jié)果顯示此13個(gè)差異蛋白質(zhì)，大部分(84.6％)具有兩個(gè)或兩個(gè)以上

16、的分子功能或參與的生物學(xué)進(jìn)程，其中與結(jié)合(Binding)功能有關(guān)的占84.6％，此外，還與生物功能調(diào)節(jié)(76.9％)，細(xì)胞進(jìn)程(69.2％)，代謝進(jìn)程(69.2％)和應(yīng)激(84.6％)功能相關(guān)。我們選擇了Prenylcysteine oxidase1, Peroxiredoxin-4, Lumican和Complement factor B這四個(gè)具有一致性差異表達(dá)的蛋白標(biāo)志物進(jìn)行Western-Blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)Prenylcys

17、teine oxidase1， Peroxiredoxin-4這2個(gè)蛋白的表達(dá)量在腫瘤組織中高于正常組織。隨后對(duì)這2個(gè)蛋白進(jìn)行免疫組化驗(yàn)證，利用SPSS18.0軟（卡方檢驗(yàn)與Wilcoxon signed ranks檢驗(yàn)）對(duì)免疫組化評(píng)分進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明:與配對(duì)的正常對(duì)照組織相比，Prenylcysteine oxidase1和Peroxiredoxin-4在腫瘤組織的上調(diào)表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（二者均P＜0.01），二者分別在85％

18、和71.25％的結(jié)直腸癌組織上調(diào)表達(dá)，卡方檢驗(yàn)提示Peroxiredoxin-4的上調(diào)表達(dá)與淋巴結(jié)侵襲和TNM分期相關(guān)(P＜0.05)，Prenylcysteine oxidase1的上調(diào)表達(dá)與病例臨床特征如年齡、性別、腫瘤部位、分化程度、腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)侵襲之間并無(wú)顯著相關(guān)性。經(jīng)Logistic回歸分析病例臨床病理特征和蛋白標(biāo)志物在腫瘤組織和正常組織的差異表達(dá)程度相關(guān)性，提示Prenylcysteine oxidase1和Per

19、oxiredoxin-4在腫瘤組織和正常組織的差異表達(dá)程度均與淋巴結(jié)侵襲相關(guān)，OR值分別為3.386(95％可信區(qū)間，1.474-8.243)和2.858(95％可信區(qū)間，1.219-6.701)。Prenylcysteine oxidase1主要表達(dá)在胞漿，其陽(yáng)性表達(dá)在95％的結(jié)直腸癌組織和60％的正常對(duì)照組織中被檢測(cè)到。Peroxiredoxin-4的表達(dá)分布于胞漿和部分細(xì)胞外間質(zhì)區(qū)域，其陽(yáng)性表達(dá)可以在96.25％的結(jié)直腸癌組織和8

20、0％的對(duì)照正常組織樣本中檢測(cè)到。
　　 Prenylcysteine oxidase1診斷結(jié)直腸癌(CRC)的診斷閡值是免疫組化評(píng)分≥3，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析其CRC診斷特異度為93.75％，敏感度為76.25％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為92.4％，陰性預(yù)測(cè)值為79.8％，在該診斷閾值下，計(jì)算約登指數(shù)(YI)為70，收受者特征曲線(ROC)的曲線下面積(AUC)為89.4％。Peroxiredoxin-4診斷結(jié)直腸癌(CRC)的診斷閾值是免疫組化評(píng)分

21、≥4，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析其CRC診斷特異度為96.3％，敏感度為63.8％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為94.4％，陰性預(yù)測(cè)值為72.6％，在該診斷閾值下，約登指數(shù)為60.1，收受者特征曲線(ROC)的曲線下面積(AUC)為84.2％。
　　 結(jié)論:
　　 我們初步描繪了結(jié)直腸癌組織與血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜，篩選出了一組具有較好診斷價(jià)值的蛋白標(biāo)志物，驗(yàn)證了Prenylcysteine oxidase1和Peroxiredoxin-4在癌組織中的上