抗人CD80單鏈抗體(ScFv)及雙價抗體(diabody)的研制及生物學功能初步研究.pdf

1、CD80(也稱B7-1)是B7家族重要的共刺激分子。人CD80分子編碼基因定位于人類染色體3q13.3-q21區(qū)內，含有1491bp。CD80是分子量約為44-54kD的I型跨膜糖蛋白，主要表達在專職性抗原提呈細胞(antigen-presenting cell，APC)樹突狀細胞、單核-巨噬細胞及B淋巴細胞。CD80分子的配體為表達在T淋巴細胞表面的CD28和CTLA-4。CD80與CD28結合為T細胞的活化提供第二信號，促進T細胞的

2、增殖與分化；而與CTLA-4結合介導抑制信號，從而下調或終止T細胞效應。若缺乏此共刺激信號，抗原特異性的第一信號非但不能有效激活特異性T細胞，反而導致T細胞無能，或者耐受。研究表明，CD80介導的信號通路不僅能調節(jié)T細胞活化過程，而且還參與許多疾病的發(fā)生發(fā)展及預后狀況。
　　 單鏈抗體(single-chain variable fragment，ScFv)是一種小分子的抗體，含有完整的抗原結合位點，由重鏈可變區(qū)(the var

3、iable heavy chain，VH)和輕鏈可變區(qū)(the variable light chain，VL)通過一段連接肽連接而成，大小為26-28kDa。VH和VL之間的連接肽長度為10-25個氨基酸，最為普遍的為(Gly4Ser)3十五肽。Diabody是單鏈抗體的二聚體形式，是通過將單鏈抗體VH和VL之間的連接肽縮短至3-10個氨基酸時，可促進分子間VH和VL的配對而形成。
　　 第一部分抗人CD80單鏈抗體(ScFv

4、)的研制及生物學功能初步研究
　　 1.目的：構建及表達抗人CDS0單鏈抗體(ScFv)，鑒定其抗原抗體結合活性，并初步研究其生物學功能。
　　 2.方法：采用RT-PCR法從分泌鼠抗人CD80 McAb的雜交瘤細胞株(4E5)中克隆VH和VL基因。用重疊延伸拼接PCR方法構建具有前導肽的L-VH-Linker-VL單鏈抗體基因，并克隆至pIRES2-EGFP表達載體，脂質體法轉染中華倉鼠卵巢細胞(CHO)，G418加壓

5、篩選。純化抗人CD80-ScFv，分析其效價，并鑒定其對膜型CD80的識別。競爭抑制實驗分析抗人CD80-ScFv與相應抗原的結合能力。MTT法體外分析抗人CD80-ScFv對Raji細胞體外增殖的抑制作用和對CD80介導的共刺激信號的阻斷作用。
　　 3.結果：構建的抗人CD80-ScFv基因全長為828bp，經測序含有信號肽和連接肽編碼基因。實驗獲得穩(wěn)定分泌細胞株(命名為SA-Ⅱ)。上清中抗體得率為15.12mg/L，相對效

6、價為2.0μg/5×105個細胞。該抗體與天然表達CD80分子的Raji和Daudi細胞陽性結合率分別為96.6％和95.0％。抗人CD80-ScFv對鼠源親本抗體4E5與抗原結合的競爭抑制率達98.67％，并能抑制Raji細胞的體外增殖，而且能阻斷CD80介導的共刺激信號轉導，抑制PBMC的增殖，增殖率下降43.48％。
　　 4.結論：成功構建的表達抗人CD80-ScFv的細胞株，其分泌的抗體具有良好的生物學活性。該抗體的研

7、制在CD80及相關分子的基礎或/及臨床研究中具有重要的應用價值。
　　 第二部分抗人CD80雙價抗體(diabody)的研制及生物學功能初步研究
　　 1.目的：構建及表達抗人CD80雙價抗體(diabody)，并初步研究其生物學功能。
　　 2.方法：PCR法獲得輕重鏈可變區(qū)基因，構建表達載體pIRES2-EGFP/diabody。將pIRES2-EGFP/diabody轉染中華倉鼠卵巢細胞(CHO)，G418

8、加壓，篩選穩(wěn)定高表達細胞株，擴大培養(yǎng)并收集上清，經鎳柱純化，并經變性及非變性SDS-PAGE電泳對抗體分子的雙體性進行鑒定。以鼠源性親本抗體4E5為對照，測定抗人CD80-diabody的效價。采用免疫熒光及流式細胞術(FCM)分析抗體與細胞膜型CD80分子的結合活性及與鼠源性親本抗體4E5的競爭抑制效應；MTT法分析該抗體對天然高表達CD80的Raji細胞體外增殖的影響，同時分析其對CD80介導的共刺激信號阻斷作用的影響。
　　

9、 3.結果：成功構建抗人CD80-diabody表達載體，基因全長為798bp，含有信號肽和Gly4Ser連接肽編碼基因。獲得了穩(wěn)定分泌雙價抗體的細胞株(命名為SA-Ⅲ)，培養(yǎng)上清中純化抗體的得率為15mg/L，PAGE結果顯示其為一個二聚體，Mr約為53kDa(抗人CD80-ScFv Mr約為27kDa)?？谷薈D80-diabody的效價為1.5μg/5×105個細胞，與L929-CD80、Raji及Daudi的陽性結合率分別為9