Nestin陽性小鼠神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤模型的建立及病理學觀察.pdf

1、研究背景和研究目的:
　　 人原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)病率約2～5/10萬;并且這些腫瘤中，85％為顱內(nèi)腫瘤，15％為椎管內(nèi)腫瘤。顱內(nèi)腫瘤以膠質(zhì)瘤最為多見（約占40％），其次為腦膜瘤(13％～19％)，聽神經(jīng)瘤（神經(jīng)鞘瘤）(8％～9％)。膠質(zhì)瘤中，惡性星形膠質(zhì)細胞瘤（膠質(zhì)母細胞瘤）占50％～60％，良性星形膠質(zhì)細胞瘤約占25％～30％。兒童的顱內(nèi)腫瘤發(fā)病率甚高，僅次于白血病而占小兒惡性腫瘤的第2位;兒童顱內(nèi)腫瘤除膠質(zhì)瘤外，髓母細

2、胞瘤最常見。
　　 神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的主要癥狀:
　　 ①腫瘤壓迫或破壞周圍腦組織所引起的局部神經(jīng)癥狀，如癲癇、癱瘓、視野缺損等。
　　 ②顱內(nèi)占位病變引起顱內(nèi)壓增高的癥狀，表現(xiàn)為頭痛、嘔吐、視神經(jīng)乳頭水腫等。
　　 nestin是一種中間絲類型的蛋白，能夠特異性的表達在神經(jīng)上皮干細胞上，為神經(jīng)干細胞的特征性標志物之一。
　　 nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠是一種最常用的研究神經(jīng)干細胞的一種工具鼠

3、，該GFP基因插入在nestin啟動子下游，受nestin基因的調(diào)控，應用nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠可以標記和示蹤神經(jīng)干細胞的分化和遷移。
　　 目前對于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的研究已經(jīng)有了很大的進展，但是對于神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的早期細胞起源和分子發(fā)生機制并不明確。大部分神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤在早期由于不能被及時發(fā)現(xiàn)，很難獲得腫瘤早期的標本。當患者出現(xiàn)較明顯的臨床癥狀時，疾病大都已經(jīng)發(fā)展到中晚期階段，此時的細胞類型和分子標記已經(jīng)發(fā)生了較大的變化，

4、因此其相應研究只是一種回顧性研究，并不能如實反映神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的早期變化。Nestin陽性報告小鼠神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤模型的建立將為研究神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的早期細胞起源和分子發(fā)生機制提供重要的工具，其可能的應用如下:
　　 (1)揭示神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的早期細胞起源及分子發(fā)生機制;
　　 (2)利用腦內(nèi)神經(jīng)干細胞位置的相對局限性和與神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤存在的異位性來研究神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤干細胞的來源，闡明神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的可能機制;
　　 (3)研

5、究神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤干細胞的來源和神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的轉(zhuǎn)化靶點不僅對神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病機制具有重要意義，而且對神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的治療策略亦具有指導意義，即室管膜下層殘存的腫瘤干細胞是新的治療靶點;
　　 (4)研究室管膜下層腫瘤干細胞遠處遷移能力，探索神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的轉(zhuǎn)移機制。
　　 我們的研究包含以下幾個部分:首先我們對nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠的特征進行了形態(tài)學觀察;在此基礎(chǔ)上，我們應用ENU化學誘導nestin-GFP轉(zhuǎn)基因

6、報告小鼠，試圖建立nestin陽性報告小鼠神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤模型，并對其進行形態(tài)學的觀察;最后，我們探討其他方式建立nestin陽性報告小鼠神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤模型的建立方法及初步的研究。
　　 方法:
　　 1.nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠的形態(tài)學觀察
　　 (1)應用整體熒光成像觀察nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠在胚胎時期和出生后nestin的表達及動態(tài)變化;
　　 (2)應用免疫組化和免疫熒光觀察成年n

7、estin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠腦的nestin的定位和表達。
　　 2.ENU化學誘導nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠后形態(tài)學觀察
　　 (1)胎盤誘導
　　 取妊娠末期nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠19只，按8個劑量:50mg/kg、83mg/kg、167mg/kg、200mg/kg、233mg/kg、250mg/kg、267mg/kg、300mg/kg經(jīng)腹腔內(nèi)一次性注射1％ ENU溶液，子代小鼠出生三

8、周后與母鼠分開，雌雄分籠單獨喂養(yǎng)。仔細觀察子代小鼠的臨床癥狀，包括睡眠、食欲、步態(tài)、體溫、精神、體重、毛發(fā)的色澤等。
　　 (2)直接誘導
　　 取成年nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠13只，按200mg/kg一次性腹腔注射1％ENU溶液，雌雄分籠單獨喂養(yǎng)。仔細觀察誘導小鼠的臨床癥狀，包括睡眠、食欲、步態(tài)、體溫、精神、體重、毛發(fā)的色澤等。
　　 解剖出現(xiàn)癥狀和頻臨死亡的二種方法誘導得到的小鼠，所有標本經(jīng)固定、脫

9、水、石蠟包埋后切片，行HE染色，光鏡下判斷腫瘤生長情況。
　　 3.nestin陽性小鼠髓母細胞瘤模型的建立及初步研究
　　 (1)nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠和Ptch雜合子小鼠(Ptch-/+)雜交，獲得nestin陽性Ptch雜合子小鼠（nestin-GFP-/+/Ptch-/+）;
　　 (2)提取子代小鼠的DNA后，行PCR，然后瓊脂糖凝膠電泳，對小鼠基因進行鑒定;
　　 (3) nest

10、in陽性Ptch雜合子小鼠成瘤后，對成瘤小鼠的腦進行肉眼大體和整體熒光成像的觀察;
　　 (4) nestin陽性Ptch雜合子小鼠（nestin-GFP-/+/Ptch-/+）成瘤后，對成瘤小鼠的腦組織進行組織病理學觀察;
　　 (5) nestin陽性報告小鼠髓母細胞瘤模型發(fā)生、發(fā)展不同階段的腦組織的組織學動態(tài)觀察。
　　 結(jié)果:
　　 1.在整體熒光成像下觀察nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠，發(fā)現(xiàn)

11、:
　　 (1)大腦、小腦及嗅球在三周前 nestin均有表達，并且各個部分之間表達強度沒有明顯差異;在三周后大腦和小腦表達均明顯減弱;而嗅球在不同的發(fā)育階段nestin均明顯表達，與不同的發(fā)育階段無關(guān)。
　　 (2)小鼠胰腺中nestin的表達較強且較恒定，與不同的發(fā)育階段無關(guān)。
　　 2.免疫組化和免疫熒光結(jié)果表明，大部分nestin陽性細胞位于腦室周圍室管膜細胞的胞漿，并且呈強陽性表達;部分nestin陽性

12、細胞在大腦皮質(zhì)、大腦髓質(zhì)、海馬及小腦有散在表達。
　　 3.取妊娠末期nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠19只，按8個劑量經(jīng)腹腔內(nèi)一次性注射1％ ENU溶液，共產(chǎn)出110只子代小鼠，具體病變?nèi)缦?
　　 (1)肺腺瘤22例，平均成瘤時間約為11個月;肺腺癌24例，平均成瘤時間約為11個月;淋巴瘤5例（伯基特樣淋巴瘤2例，彌漫大B細胞樣淋巴瘤3例），平均成瘤時間約為7個月;卵巢腫瘤1例，成瘤時間約為14個月;大腦海綿狀血管

13、瘤1例，成瘤時間約為8個月。
　　 (2)按50mg/kg胎盤誘導9只子代小鼠，有2只子代小鼠成瘤，成瘤率為22.2％;83mg/kg劑量胎盤誘導時生出子代小鼠26只，有6只子代小鼠成瘤，成瘤率為23.1％;167mg/kg胎盤誘導17只，有6只小鼠成瘤，成瘤率為35.3％;200mg/kg胎盤誘導18只，有7只小鼠成瘤，成瘤率為38.9％;233mg/kg胎盤誘導17只，有12只小鼠成瘤，成瘤率為70.6％;250mg/kg胎

14、盤誘導7只，有6只小鼠成瘤，成瘤率為85.7％;267mg/kg胎盤誘導8只，有7只小鼠成瘤，成瘤率為87.5％;300mg/kg胎盤誘導8只，有7只小鼠成瘤，成瘤率為87.5％。劑量和成瘤率的差異具有顯著統(tǒng)計學意義，劑量越高成瘤率越高(x2=25.300，P＜0.001)。
　　 4.使用200mg/kg劑量的ENU直接誘導成年nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠13只，有6只小鼠成瘤，均為胸腺淋巴瘤，平均成瘤時間約為6個月，成

15、瘤率為46.2％。
　　 5.ENU經(jīng)胎盤誘導nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠110只，有53只小鼠成瘤，成瘤率為48.2％;使用200mg/kg劑量的ENU直接誘導成年nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠13只，成瘤的小鼠有6只，成瘤率為46.2％。直接誘導和經(jīng)胎盤誘導成瘤率的差異不具有統(tǒng)計學意義(x2=0.019，P=0.890)。
　　 6.通過Ptch雜合子小鼠與nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠雜交獲得nest

16、in陽性Ptch雜合子小鼠(nestin-GFP-/+/Ptch-/+)，大約10個月之后，小鼠出現(xiàn)髓母細胞瘤樣改變，瘤組織nestin呈強陽性表達，組織病理學證實nestin陽性Ptch雜合子小鼠可發(fā)展成髓母細胞瘤，在髓母細胞瘤形成的早期我們觀察到nestin陽性Ptch雜合子小鼠的小腦外顆粒層細胞明顯增生。
　　 7.nestin陽性報告小鼠的髓母細胞瘤模型不同階段形態(tài)學動態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)髓母細胞瘤形成的初期小鼠模型側(cè)腦室的一側(cè)

17、細胞明顯增生并且側(cè)腦室處增生的細胞有較強的nestin表達，在髓母細胞瘤形成的中期小鼠模型的小腦外顆粒層細胞明顯增生并且增生的外顆粒層細胞有較強的nestin表達，在成瘤后觀察到腫瘤細胞有較強的nestin表達。
　　 結(jié)論:
　　 1.nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠腦內(nèi)nestin陽性的細胞的大部分位于腦室室管膜下層(SVZ)，少部分散在分布于腦的其他部位，與神經(jīng)干細胞的定位和分布一致，所以nestin-GFP轉(zhuǎn)基

18、因報告小鼠可以很好地應用于神經(jīng)干細胞的示蹤和分析。
　　 2.ENU化學誘導nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠可誘導小鼠肺腺瘤、肺腺癌、淋巴瘤、腦海綿狀血管瘤、卵巢腫瘤，但是不能誘導神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤。
　　 3.應用Ptch雜合子小鼠與nestin-GFP轉(zhuǎn)基因報告小鼠雜交獲得nestin陽性Ptch雜合子小鼠，可成功建立nestin陽性報告小鼠的髓母細胞瘤模型，為髓母細胞瘤的早期細胞起源及分子發(fā)生機制的研究提供了重要的工具