鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑對壓力超負(fù)荷性心肌肥厚、心衰小鼠左心室跨壁L-型鈣電流的調(diào)節(jié).pdf

1、心肌肥厚、心衰常常伴發(fā)心律失常,特別是心衰時嚴(yán)重的室性心律失常致心源性猝死(sudden cardiac death,SCD)的發(fā)生率大大提高,成為心血管病死亡的主要原因。最新資料顯示我國SCD發(fā)生率平均為41.84例/10萬人,以13億人口推算,SCD高達(dá)54.4萬例/年,居各國之首。自從1998年Molkentin等提出細(xì)胞內(nèi)Ca2+i/CaM/Calcineurin/NFAT。信號傳導(dǎo)通路的激活是產(chǎn)生病理性心肌肥厚和心衰的重要機(jī)制

2、以來,越來越多的實(shí)驗發(fā)現(xiàn)這條鈣信號通路的激活亦是造成病理情況下心肌細(xì)胞電生理重構(gòu)的原因。
　　 我們小組前期實(shí)驗表明,在小鼠心肌肥厚,心衰發(fā)展過程中動作電位(AP)延長形式不同,心肌肥厚階段外膜下細(xì)胞APD延長超過內(nèi)膜下細(xì)胞,AP跨壁復(fù)極梯度消失;而心衰期主要的變化是內(nèi)膜AP的延長,造成內(nèi)、外膜下心肌細(xì)胞復(fù)極離散度增大。應(yīng)用Calcineurin抑制劑環(huán)孢素A(CsA)后,明顯上調(diào)了左心室內(nèi)膜下和外膜下細(xì)胞Ito,Ikslow,

3、Iss的水平,縮短了內(nèi)膜下細(xì)胞APD,心衰心臟增大的AP跨壁異質(zhì)性得到了部分逆轉(zhuǎn),即異質(zhì)性減小(見師晨霞博士論文)。那么心肌肥厚階段AP跨壁異質(zhì)性減少是否也和CaN通路有關(guān)?心肌肥厚、心衰是個動態(tài)發(fā)展的過程,我們推測在不同的肥厚模型,甚至同一模型的不同階段,該信號通路活性、致肥厚作用和對心臟電生理特性的影響可能并不完全相同。
　　 本實(shí)驗擬在壓力超負(fù)荷小鼠心肌肥厚、心衰模型上,應(yīng)用環(huán)孢素A(CsA),阻斷Calcineurin信

4、號通路,通過測定心臟血流動力學(xué)及膜片鉗技術(shù)記錄左室游離壁內(nèi)、外膜下細(xì)胞AP和Ica-L的跨壁變化,試圖評價這條通路在心肌肥厚、心衰發(fā)展過程中對心臟的功能和電生理特性的影響是否相同。
　　 第一部分：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑對小鼠壓力超負(fù)荷性心肌肥厚、心衰模型血流動力學(xué)的影響。
　　 目的:
　　 采用壓力超負(fù)荷小鼠心肌肥厚、心衰模型,通過整體模型給予CaN特異性抑制劑CsA,試圖評價這條通路在心肌肥厚、心衰發(fā)展過程中

5、對心臟功能所起的作用是否相同。
　　 方法:
　　 (1)動物模型的制備:將4周齡,體重(20±2)g的小鼠麻醉后開胸,對主動脈弓進(jìn)行結(jié)扎,致主動脈弓狹窄65％-70％,使左室后負(fù)荷增加,建立壓力超負(fù)荷性心肌肥厚、心衰模型。
　　 (2)實(shí)驗分組:選取術(shù)后5周、11周分別作為肥厚期、心衰期的考察點(diǎn)。分別于術(shù)后第3周、第9周皮下注射CsA,25mg/kg,2次/天,持續(xù)2周,即Band5w+CsA、Band5w+V

6、eh、Bandllw+CsA、Bandllw+Veh組。為了進(jìn)一步說明CsA對于正常和病理狀態(tài)下心臟作用的選擇性,在Sham組中設(shè)與Band組同期的治療組和溶劑對照組,即Sham5w+Veh、Sham5w+CsA、Sham11w+Veh和Sham11w+CsA組。
　　 (3)對于手術(shù)各組分別檢測體重、攝食量、心質(zhì)量指數(shù)、肺質(zhì)量指數(shù)、血流動力學(xué)參數(shù):SBP、LVSP、LVEDP、dp/dt max、dp/dt min,并與同期假

7、手術(shù)各組進(jìn)行比較。
　　 結(jié)果:
　　 (1)5周各組動物一般狀態(tài)較好,無死亡,體重、攝食量均無顯著性差異。與同時期Sham組相比,Band11w+Veh和Band11w+CsA組動物體重和攝食量明顯減少(P＜0.01)。
　　 (2)同Sham5w+Veh組相比,Band5w+Veh組心室重量、心質(zhì)量指數(shù)、肺臟重量、肺質(zhì)量指數(shù)均顯著性增加(P＜0.01);而Sham5w+CsA組各參數(shù)無顯著性改變。與Band5

8、w+Veh組相比,Band5w+CsA組心室重量、心質(zhì)量指數(shù)、肺臟重量、肺質(zhì)量指數(shù)均有顯著減少(P＜0.01),但是沒有減少到Sham5w+Veh組水平。同Sham11w+Veh組相比,Band11w+Veh組心室重量、心質(zhì)量指數(shù)、肺臟重量、肺質(zhì)量指數(shù)均有顯著性增加(P＜0.01);而Sham11w+CsA組各參數(shù)無顯著性改變(P＞0.05)。與Band11w+Veh組相比,Band11w+CsA心室重量、心質(zhì)量指數(shù)、肺臟重量、肺質(zhì)量指

9、數(shù)無顯著性差異,仍顯著高于Sham11w+Veh組。與Band5w+Veh組相比,Band11w+Veh組和Band11w+CsA組的心室重量、心質(zhì)量指數(shù)均顯著下降(P＜0.05),肺臟重量、肺質(zhì)量指數(shù)無顯著性改變。
　　 (3)各組心率無顯著性差異。同Sham5w+Veh組相比,Band5w+Veh組SBP、LVSP、LVEDP、dp/dt max、dp/dt min均顯著性增加(P＜0.01)。與Band5w+Veh組相比,

10、Band5w+CsA組SBP、LVSP、LVEDP、dp/dt max、dp/dt min均顯著性減少(P＜0.05或P＜0.01),但是沒有減少到Sham5w+Vch組水平。Sham5w+CsA組與Sham5w+Veh組相比沒有顯著性差異。同Sham11w+Veh組相比,Band11w+Veh組SBP、LVSP、LVEDP顯著性增加(P＜0.05),而dp/dt max和dp/dt min降低(P＜0.05)。與Band11w+Veh

11、組相比,Band11w+CsA組SBP、LVSP、LVEDP、dp/dt max和dp/dt rain均無顯著性差異,仍顯著高于或低于Sham11w+Veh組(P＜0.05)。Sham11w+CsA組與Sham11w+Veh組相比沒有顯著性差異。與Band5w+Veh組相比,Band11w+Veh組和Band11w+CsA組SBP、LVSP、dp/dt max、dp/dt min均顯著下降(P＜0.05),LVEDP顯著增加(P＜0.0

12、1)。
　　 結(jié)論:
　　 Calcineurin信號通路激活是致心肌肥厚的重要途徑,抑制該通路可以使肥厚期心臟的功能得以部分逆轉(zhuǎn)。
　　 第二部分：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑對心肌肥厚小鼠左心室跨壁動作電位的調(diào)節(jié)。
　　 目的:
　　 采用打孔膜片鉗技術(shù),應(yīng)用環(huán)孢素A(CsA),阻斷Calcineurin信號通路,觀察小鼠壓力超負(fù)荷性心肌肥厚左室游離壁心內(nèi)膜下、心外膜下心室肌細(xì)胞動作電位跨壁異質(zhì)性的變

13、化。
　　 方法:
　　 以第一部分中肥厚期動物為考察對象,于術(shù)后第3周皮下注射CsA,25mg/kg,2次/天,持續(xù)2周,即Band5w+CsA、Band5w+Veh。在Sham組中設(shè)與Band組同期的治療組和溶劑對照組,即Sham5w+Veh、Sham5w+CsA。利用酶解法分離得到各組小鼠左室游離壁內(nèi)、外膜下心肌細(xì)胞。采用打孔式膜片鉗技術(shù)記錄單個心肌細(xì)胞的動作電位,計算動作電位復(fù)極達(dá)50％的時程(APD50)和動作

14、電位復(fù)極達(dá)90％的時程(APD90)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)Sham5w+Veh組和Sham5w+CsA組動物左室游離壁內(nèi)、外膜下細(xì)胞AP形態(tài)和APD存在著明顯的差異,內(nèi)膜APD明顯長于外膜。與Sham5w+Veh組相比,Sham5w+CsA組動物APD50,APD90沒有顯著性差異。
　　 (2)主動脈部分狹窄5w時,Band5w+Veh組(術(shù)后3w皮下注射NaCl)小鼠外膜下細(xì)胞APD50,APD90明

15、顯延長,與同時期的Sham5w+Veh組相比,延長了23％和185％(P＜0.01),而內(nèi)膜下細(xì)胞僅APD50延長了30％(P＜0.05),APD90沒有改變,即動作電位異質(zhì)性明顯減小。
　　 (3)與同時期的Band5w+Veh組動物相比,Band5w+CsA組動物外膜下細(xì)胞APD50沒有改變,但APD90明顯縮短,縮短了24％(P＜0.05),沒有恢復(fù)到Sham5w+Veh組水平;內(nèi)膜下細(xì)胞APD50,APD90沒有改變,即

16、給CsA后,心肌肥厚小鼠的左心室跨壁動作電位異質(zhì)性增大,但沒有恢復(fù)到正常水平。
　　 結(jié)論:
　　 Calcineurin信號通路激活是造成肥厚期APD異質(zhì)性減小的主要原因。阻斷該通路,有助于恢復(fù)正常的AP跨壁異質(zhì)性。
　　 第三部分：鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑對壓力負(fù)荷性心肌肥厚、心衰小鼠左心室跨壁L-型鈣電流的調(diào)節(jié)；
　　 目的:
　　 采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù),通過應(yīng)用Calcineurin的特異性抑

17、制劑環(huán)孢素A(CsA),阻斷Calcineurin信號通路,觀察壓力負(fù)荷性心肌肥厚、心衰時,小鼠左心室心內(nèi)、外膜下細(xì)胞ICa-L的改變。
　　 方法:
　　 繼續(xù)以第一部分中分組因素為考察點(diǎn),利用酶解法分離得到各組小鼠左室游離壁內(nèi)、外膜下心肌細(xì)胞。觀察壓力負(fù)荷性心肌肥厚、心衰時,小鼠左心室心內(nèi)、外膜下細(xì)胞ICa-L的改變。
　　 結(jié)果:
　　 (1)與同時期的Sham+Veh組相比,Sham5w+CsA組

18、和Sham11w+CsA組細(xì)胞電容沒有區(qū)別。Band5w+Veh組心內(nèi)、外膜下細(xì)胞電容明顯增大,分別增加46.7％和42.9％(P＜0.01),Band11w+Veh組心內(nèi)、外膜下細(xì)胞電容也分別增加61.1％和80.4％(P＜0.01)。給予CsA后,與同時期的Band+Veh組相比,Band5w+CsA組心內(nèi)、外膜下細(xì)胞電容明顯減小,分別降低了17.7％和18.O％,(P＜0.05),Band11w+Veh組心內(nèi)、外膜下細(xì)胞電容也分別

19、降低了14.1％和16.7％(P＜0.05),均未減小到同時期假手術(shù)組水平。
　　 (2)Sham+Veh組和Sham+CsA組小鼠內(nèi)、外膜細(xì)胞的ICa-L密度無明顯差別。與同時期Sham+Veh相比,Band5w+Veh和Band11w+Veh內(nèi)膜下細(xì)胞ICa-L密度顯著降低(P＜0.01);給予CsA后,與同時期的Band+Veh組相比,Band5w+CsA組和Band11w+CsA組Ica-L密度繼續(xù)降低,在+20mV～+

20、40mV的4個電壓下,Band5w+CsA組ICa-L密度分別降低了25.1％、31.8％和36.5％(P＜0.01或P＜0.05),而在+10mV～+40mV的4個電壓下,Band11w+CsA ICa-L密度分別降低了19.1％、23.2％、25.3％和32.3％(P＜0.01或P＜0.05);各組激活電位、峰電位和翻轉(zhuǎn)電位沒有改變。而與同期的Sham+Veh組相比,Band5w+Veh,Band5w+CsA和Band11w+Veh